Kitle Fotometrisi ile Antikor-Antijen Affinitesinin Hızlı Tayini
Summary
Biz kitle fotometri (MP) kullanarak antijen-antikor afinite ölçümleri için tek moleküllü bir yaklaşım açıklar. MP tabanlı protokol hızlı, doğru, malzeme çok az miktarda kullanır ve protein modifikasyonu gerektirmez.
Abstract
Antijen-antikor etkileşimlerinin özgüllüğü ve yakınlığının ölçüleri tıbbi ve araştırma uygulamaları için kritik öneme bağlıdır. Bu protokolde, bu amaçla yeni bir tek molekültekniği olan kütle fotometrisinin (MP) uygulanmasını açıklıyoruz. MP, moleküler kütleleri ve antikor ve antikor komplekslerinin popülasyonlarını tek moleküllü düzeyde algılayan ve ölçen etiket ve hareketsiz bir tekniktir. MP birkaç dakika içinde antijen-antikor örneğini analiz eder, bağlayıcı afinite kesin belirlenmesi için izin ve aynı anda stokiyometri ve proteinlerin oligomerik durumu hakkında bilgi sağlayan. Bu protein ve hiçbir pahalı sarf malzemeleri sadece pikomol miktarları gerektiren basit ve basit bir tekniktir. Aynı prosedür, moleküler kütlesi 50 kDa’dan büyük olan proteinler için protein-protein bağlanmasını incelemek için de kullanılabilir. Çok valent protein etkileşimleri için, birden fazla bağlama sitelerinin yakınlıkları tek bir ölçümde elde edilebilir. Ancak, tek moleküllü ölçüm modu ve etiketleme eksikliği bazı deneysel sınırlamalar getirir. Bu yöntem, alt mikromolar etkileşim yakınlıklarının, moleküler kütleli 20 kDa veya daha büyük antijenlerin ve nispeten saf protein örneklerinin ölçümlerine uygulandığında en iyi sonuçları verir. Ayrıca, temel veri analizi yazılımını kullanarak gerekli montaj ve hesaplama adımlarını gerçekleştirme prosedürünü de açıklarız.
Introduction
Antikorlar moleküler biyolojinin her yerde bulunan araçları haline gelmiştir ve hem tıbbi hem de araştırma uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Tıpta, onlar kritik tanı önemlidir, ama onların terapötik uygulamaları da genişletiyor ve yeni antikor tabanlı tedaviler sürekligeliştirilmektedir 1,2,3,4. Antikorların bilimsel uygulamaları arasında immünoresans5,immünopredikasyon6,akış sitometrisi7, ELISA ve batı lekelenme gibi birçok vazgeçilmez laboratuvar tekniği bulunmaktadır. Bu uygulamaların her biri için, bağlanma yakınlığı ve özgüllüğü de dahil olmak üzere antikor bağlayıcı özelliklerinin doğru ölçümlerinin alınması çok önemlidir.
İlk ticari yüzey plazmon rezonans (SPR) cihazı 1990 yılında tanıtıldı bu yana, optik biyosensörler antikor karakterizasyonu “altın standart” haline gelmiştir, ancak Diğer teknikler, ELISA dahil olmak üzere, aynı zamanda rutin antikor yakınlıkları ölçmek için kullanılır8,9. Bu yöntemler genellikle immobilizasyon veya potansiyel ilgi etkileşimi etkileyebilir analiz moleküllerinin etiketleme gerektirir. Sonuçlar veri analizi için toplanmadan önce birden çok tahlil adımı içeren nispeten yavaşlardır. Yakın zamanda geliştirilen tek moleküllü bir yöntem olan kütle fotometrisi (MP), mikroskop kapağının yüzeyine indiklerinde molekülleri doğrudan çözeltide algılar10,11. MP’nin kullandığı ışık saçılımı tabanlı optik algılama protein etiketlemeveya modifikasyon gerektirmez. Bireysel protein molekülleri, görüntüde görünen koyu noktalar olarak interferometrik saçılma mikroskobu tarafından kaydedilir(Şekil 1D), ve birkaç bin molekül bir dakikalık veri toplama sırasında tespit edilebilir12. Her bir parçacık tarafından oluşturulan sinyal ölçülür ve kontrast değeri (göreli karanlık) hesaplanır. İnterferometrik kontrast değerleri proteinlerin moleküler kütleleri ile orantılıdır, bu da antijen-antikor karışımındaki bağlı ve serbest türlerin tanımlanmasına olanak sağlar. Aynı zamanda, moleküler iniş olayları sayarak, MP doğrudan tür popülasyonları ölçer. Bu, MP tabanlı yöntemlere birden çok bağlama alanının benzerliklerini bağımsız olarak ölçmek için benzersiz bir yetenek sağlar.
Antijen(Ag)moleküllerinin bozulmamış antikor(Ab)iki bağlayıcı siteye bağlanması şu şekilde tanımlanabilir:
denge ilişkisi sabitleri K a1 ve Ka2 olarak tanımlanır:
ci ve fi bileşenininkonsantrasyonu ve fraksiyonu temsil nerede , sırasıyla. Toplam antijen konsantrasyonu (cAg)tot olarak ifade edilebilir:
Antikor(cAb)tot ve antijen(cAg)tot toplam konsantrasyonları bilindiğinden, bu denklem doğrudan MP ölçümleri elde edilen deneysel bileşen fraksiyonları sığdırmak ve denge ilişkilendirme sabitleri Ka1 ve Ka2 hesaplamak için kullanılabilir (Ek Bilgibakınız).
MP verileri ayrıca iki antikor bağlama siteleri11arasındaki işbirliği tahmin etmek için kullanılabilir. Aynı mikroskobik bağlama sabitlerine sahip iki antikor paratopiniçin Ab popülasyon sürecini açıklayan istatistiksel faktörler · Ag ve Ab· Ag2 kompleksleri görünür makroskopik denge sabitleri Ka1 ve Ka2 sayısal eşit olmaz ve Ka1 = 4Ka2dikte . Bu nedenle, Ka1 < 4Ka2’nin deneysel değerleri iki antikor bağlama alanı arasında pozitif cooperativity gösterir. Benzer şekilde, Ka1 > 4Ka2 negatif cooperativity gösterir.
Antijen-antikor bağlayıcı afinite MP ölçümleri hızlı ve malzeme küçük bir miktar gerektirir. Denge sabit hesaplamaları için kullanılan MP kütle dağılımları örnek özellikleri hakkında ek bilgi sağlar ve tek bir deneyde örnek saflığı, oliomerizasyon ve toplamanın değerlendirilmesini sağlar. Aynı yöntem yüksek afinite protein-protein bağlanmasını ölçmek için kullanılabilir ve MP özellikle çok valent protein etkileşimleri çalışmaları için yararlıdır. Çoklu protein kompleksleri genellikle büyük moleküler kitlelere sahiptir, MP tespiti için optimal, ve tek moleküllü veri stokiyometri ölçmek ve aynı anda birden fazla bağlama sitelerinin afinitelerini hesaplamak için kullanılabilir. Bu bilgileri genellikle toplu tabanlı yöntemler kullanarak elde etmek zordur.
Modifikasyonlar olmadan, mevcut protokol nispeten yüksek afinite, 20 kDa veya daha büyük bir moleküler kütle antijenleri ile alt mikromolar etkileşimleri ölçümleri için uygundur. Optimal sonuçlar için, protein stokları yüksek saflıkta olmalıdır, ancak belirli bir tampon gereksinimleri vardır. MP kullanılarak, antijen-antikor bağlama az beş dakika içinde değerlendirilebilir. Doğru Kd hesaplamaları için gerekli veri toplama ve analiz 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada özetlenen Toplu Fotometri tabanlı protokol antijen-antikor bağlayıcı yakınlıkları ölçme hızlı ve doğru bir yöntem sağlar. MP analizi çok az miktarda malzeme kullanır ve stokiyometri, oliomerizasyon ve saflık da dahil olmak üzere ek bilgiler aynı verilerden değerlendirilebilir(Şekil 5). Modifikasyonlar olmadan, bu yöntem yaklaşık 5 nM ila 500 nM aralığındaki dissosilasyon sabitlerinin ölçümleri ve moleküler kütlesi yaklaşık 20 kDa veya daha büyük ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keir Neuman’a el yazını eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma NHLBI, NIH intramural programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24×24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer’s Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
- Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer – A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
- Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Rosenberg, M. I. . Protein Analysis and Purification. , (2005).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
- Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
