कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का उपयोग करके ईजीएफआर और आरएएस अवरोधकों की पहचान
Summary
आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का उपयोग दवा खोज के लिए एक सरल और सस्ती मॉडल के रूप में किया जा सकता है। यहां वर्णित कैंसर रोधी चिकित्सीय की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो आरएएस और ईजीएफआर प्रोटीन के डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को रोकता है।
Abstract
एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) और इसके डाउनस्ट्रीम इफेक्टर आरएएस के प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण में बदलाव को कैंसर सहित कई बीमारियों में फंसाया गया है । मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि सी एलिगेंस के पास एक विकासवादी और कार्यात्मक रूप से संरक्षित ईजीएफआर-आरएएस-ईआरके मैप सिग्नल झरना है जो योनी के विकास के लिए केंद्रीय है। आरएएस समरूप LET-60 और ईजीएफआर होमलॉग ले-23 में कार्य उत्परिवर्तन का लाभ इन कीड़ों के वेंट्रल शरीर की दीवार के साथ दृश्यमान गैर-कार्यात्मक एक्टोपिक छद्म काल्वत्व की पीढ़ी को प्रेरित करता है। इससे पहले, इन कीड़ों में मल्टीवेल्वल (मव) फेनोटाइप को छोटे रासायनिक अणुओं द्वारा बाधित दिखाया गया है। यहां हम ईजीएफआर और आरएएस प्रोटीन की गतिविधियों को समाप्त करने वाले अवरोधकों की पहचान करने के लिए तरल आधारित परख में कीड़े का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस परख का उपयोग करके, हम आर-फेंडिलाइन, कश्मीर-आरएएस के अप्रत्यक्ष अवरोधक को दिखाते हैं, चलो-60 (n1046) और लेट-23 (sa62) उत्परिवर्ती कीड़े में व्यक्त किए गए एमयूवी फेनोटाइप को दबा देते हैं। परख सरल, सस्ती है, सेटअप करने के लिए समय लेने वाली नहीं है, और कैंसर रोधी चिकित्सा विज्ञान की खोज के लिए एक प्रारंभिक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
जीवों के भीतर विकासात्मक घटनाओं को विनियमित करने वाले सेलुलर रास्ते सभी मेटाज़ॉन के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं। ऐसा ही एक मार्ग ईजीएफआर-आरएएस-ईआरके माइटोजेन सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके) सिग्नलिंग झरना है जो एक महत्वपूर्ण मार्ग है जो सेल प्रसार, भेदभाव, प्रवासन और अस्तित्व1, 2कोनियंत्रितकरता है। इस सिग्नलिंग मार्ग में दोष कैंसर जैसे रोग या रोग राज्यों का कारण बन सकते हैं। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) ने मानव ट्यूमर में अत्यधिक व्यक्त किया है, जिसमें मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा का 50% शामिल है, औरघातक ट्यूमर3,4, 5के विकास में योगदानदेताहै। जबकि तीन आरएएस आइसोफॉर्म एच-, के और एन-आरएएस में म्यूटेशन कई मानव कैंसर में घातक परिवर्तन के लिए प्रमुख चालक हैं । इन तीन आरएएस आइसोफॉर्म्स में से, के-आरएएस में ऑन्कोजेनिक म्यूटेशन सबसे अधिक प्रचलित हैं6,7,8। ईजीएफआर और आरएएस के कार्य करने के लिए, उन्हें प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) का स्थानीयकरण करना होगा। इन अणुओं को प्रधानमंत्री तक ले जाने से इस संकेत मार्ग 9,10की जैविक गतिविधि को पूरीतरहसे समाप्त किया जा सकता है . इसलिए प्रधानमंत्री को इन प्रोटीनों के स्थानीयकरण का अवरोध डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग और परिणामी प्रतिकूल परिणामों को अवरुद्ध करने के लिए एक चिकित्सीय रणनीति है । एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग परख का उपयोग करना, फेंडिलाइन, एक एल प्रकार कैल्शियम चैनल अवरोधक, कश्मीर-आरएएस गतिविधि11के एक अवरोधक के रूप में पहचाना गया था । पीएम के इनर पर्चा के लिए कश्मीर-रास का नैनोक्लस्टरिंग फेंडिलाइन की उपस्थिति में काफी कम हो जाता है । इसके अलावा, के-आरएएस को प्लाज्मा झिल्ली से एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), गोलगी उपकरण, एंडोसोम्स और साइटोसोल में पुनर्वितरित किया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, अग्नाशय, पेट, फेफड़े, और एंडोमेट्रियल कैंसर सेल लाइनों का प्रसार ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्ती के-आरएएस व्यक्त करना11से डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग के अवरोध से अवरुद्ध है। ये आंकड़े एक विशिष्ट कश्मीर-आरएएस कैंसर रोधी चिकित्सीय के रूप में फेंडिलाइन कार्यों का सुझाव देते हैं जो प्रधानमंत्री को आरएएस प्रोटीन के गलत स्थानीयकरण का कारण बनता है ।
नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का विकास के संदर्भ में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। कीड़े में विकास को नियंत्रित करने वाले कई सिग्नल रास्ते विकासवादी और कार्यात्मक रूप से संरक्षित हैं। उदाहरण के लिए, ईजीएफआर ने आरएएस की मध्यस्थता की सक्रियता और ईआरके मैप सिग्नल कैस्केड की बाद की सक्रियता कीड़ा12में संरक्षित है। झरना निम्नलिखित प्रोटीन द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है: एलईई-23 > एलईई-60 > एलईके-45 > एमईके-2 > एमपीके-1। LET-60 आरएएस के मुताबिक़ है, जबकि लेट-23 ईजीएफआर के मुताबिक़ है। कीड़े में, यह मार्ग योनी13के विकास को नियंत्रित करता है। योनी कीड़े के वेंट्रल बॉडी वॉल पर एक एपिथेलियल अपर्चर है जो निषेचित अंडे रखने की अनुमति देता है। कीड़े में योनी का गठन ईजीएफआर-आरएएस-मैप सिग्नल झरना के सक्रियण के ढाल के लिए वल्वल अग्रदूत कोशिकाओं (वीपीसी) के जोखिम पर निर्भर करता है। सामान्य विकास के दौरान, समीपस्थ वीपीसी को गोनाडल लंगर कोशिकाओं से 1 डिग्री और 2 डिग्री सेल फैट्स में अंतर करने के लिए मजबूत संकेत प्राप्त होते हैं जो एक कार्यात्मक योनी12को जन्म देते हैं। जबकि डिस्टल वीपीसी 3 डिग्री सेल फैट्स में अंतर करता है जो हाइपोडरमल सिंक्टियम को फ्यूज करता है और समाप्त सिग्नलिंग के कारण योनी नहीं बनाते हैं। सिग्नलिंग के अभाव में, सभी वीपीसी 3 डिग्री सेल फैट्स में अंतर करते हैं जिसके परिणामस्वरूप कोई योनी नहीं होती है। हालांकि, संविलियन सिग्नलिंग 1 डिग्री और 2 डिग्री सेल फैट्स ग्रहण करने के लिए सभी वीपीसी के शामिल होने के कारण एक या अधिक गैर-कार्यात्मक योनी का गठन करता है।
उत्परिवर्तन जो दोषपूर्ण या अत्यधिक वल्वल प्रेरण का कारण बनते हैं, कई जीन के लिए पहचाने गए हैं जो इस मार्ग का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रोटीन के लिए एन्कोड करते हैं । दोषपूर्ण वल्वल प्रेरण के परिणामस्वरूप एक वल्वलेस (वल्) फेनोटाइप होता है, जबकि अत्यधिक वल्वल प्रेरण के परिणामस्वरूप एक मल्टीवुवा (मयूवी) फेनोटाइप होता है जो पूरे वेंट्रल बॉडी वॉल में कई नॉनफंक्शनल एक्टोपिक छद्म के विकास द्वारा दर्शाया जाता है। चलो-60 (n1046) तनाव द्वारा व्यक्त Muv फेनोटाइप आरएएस में समारोह उत्परिवर्तन के लाभ के कारण है, जबकि चलो-23 (sa62) तनाव में यह EGFR14, 15में एक सक्रिय उत्परिवर्तन के कारण है । इन उत्परिवर्ती उपभेदों में मजबूत मुव फेनोटाइप को औषधीय हस्तक्षेपों से बेफिक्र दिखाया गया है जैसा कि एमईके-1 अवरोधक U0126 16, 17 के साथ let-60 (n1046) कीड़े के उपचार द्वारा प्रदर्शित किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि हमने दिखाया है कि आर-फेंडिलाइन और अवरोधक जो स्फिंगोमीलिन मेटाबोलिज्म को प्रभावित करते हैं,कीड़ा 18में फूव फेनोटाइप को दबा देते हैं । इन अवरोधकों को प्रदर्शित करने के लिए आरएएस के स्तर पर चलो-60 सिग्नलिंग को अवरुद्ध करते हैं, लिन-1 नल तनाव का उपयोग किया गया है17। लिन-1 एक Ets की तरह निरोधात्मक प्रतिलेखन कारक है जो योनी19के विकास में एक दमनकार के रूप में कार्य करता है। एलई-60 (n1046) कीड़े में मव फेनोटाइप का मजबूत प्रतिवर्तन और लिन-1 नल कीड़े पर कोई प्रभाव नहीं है कि ये संकोच आरएएस के स्तर पर होते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, हम आरएएस और ईजीएफआर प्रोटीन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। तरल-आधारित परख का उपयोग करके, हम सी एलिगेंसके लेट-60 (n1046) और लेट-23 (sa62) उत्परिवर्ती उपभेदों में एमयूवी फेनोटाइप को दबाकर आर-फेंडिलाइन के निरोधात्मक प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं। यह परख कैंसर रोधी चिकित्सीय के लिए दवा की खोज के प्रारंभिक चरण में एक उपकरण के रूप में सी एलिगेंस के उपयोग को मान्य करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
परख हम कीड़ा का उपयोग कर वर्णन सरल और EGFR और आरएएस समारोह के अवरोधकों की पहचान करने के लिए सस्ती हैं । सी एलिगेंस दवा की खोज के लिए एक आकर्षक मॉडल है क्योंकि छोटे जीवन चक्र (20 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन) और ब?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ स्वाति अरूर (एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर) को let-60 (n1046)प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं । हम लिन-1 तनाव के लिए डॉ डेविड रेनर (टेक्सास एएंडएम हेल्थ साइंस सेंटर इंस्टीट्यूट ऑफ बायोसाइंसेज एंड टेक्नोलॉजी इन ह्यूस्टन) को भी धन्यवाद देते हैं । अंत में, हम डॉ डेनिएल गार्सिन और उसकी प्रयोगशाला (टेक्सास विश्वविद्यालय, McGovern मेडिकल स्कूल) reagents के कुछ प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करते हैं । सीजीसी द्वारा कुछ कीड़े उपभेदों प्रदान किए गए थे, जिन्हें एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। इस शोध को जेएफ हैनकॉक को कैंसर प्रिवेंशन एंड रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्सास (CPRIT) अनुदान RP200047 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
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