Identifisering av EGFR- og RAS-hemmere ved bruk av Caenorhabditis elegans
Summary
Den genetisk gjennomførbare nematoden Caenorhabditis elegans kan brukes som en enkel og billig modell for legemiddeloppdagelse. Beskrevet her er en protokoll for å identifisere anticancer terapeutiske som hemmer nedstrøms signalering av RAS og EGFR proteiner.
Abstract
Endringene i plasmamembranlokaliseringen av den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR) og dens nedstrøms effektor RAS har vært involvert i flere sykdommer, inkludert kreft. Den frittlevende nematoden C. elegans har en evolusjonær og funksjonelt bevart EGFR-RAS-ERK MAP signal kaskade som er sentral for utviklingen av vulva. Gevinst av funksjonsmutasjoner i RAS homolog LET-60 og EGFR homolog LET-23 induserer genereringen av synlig ikke-fungerende ektopisk pseudovulva langs den ventrale kroppsveggen til disse ormene. Tidligere har multivulval (Muv) fenotypen i disse ormene vist seg å være hemmet av små kjemiske molekyler. Her beskriver vi en protokoll for bruk av ormen i en væskebasert analyse for å identifisere hemmere som avskaffer aktivitetene til EGFR- og RAS-proteiner. Ved hjelp av denne analysen viser vi R-fendiline, en indirekte hemmer av K-RAS, undertrykker Muv-fenotypen uttrykt i let-60(n1046) og let-23(sa62) mutant ormer. Analysen er enkel, billig, er ikke tidkrevende å sette opp, og kan brukes som en innledende plattform for oppdagelsen av anticancer terapeutiske midler.
Introduction
De cellulære veiene som regulerer utviklingshendelser innen organismer er sterkt bevart blant alle metazoer. En slik vei er EGFR-RAS-ERK mitogenaktivert protein kinase (MAPK) som signaliserer kaskade som er en kritisk vei som styrer celleproliferasjon, differensiering, migrasjon og overlevelse1,2. Defekter i denne signalveien kan føre til patologiske eller sykdomstilstander som kreft. Den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR) har vist seg å være sterkt uttrykt i menneskelige svulster, inkludert 50% av orale squamouscellekarsinomer, og bidrar til utvikling av ondartede svulster3,4,5. Mens mutasjoner i de tre RAS-isoformene H-, K- og N-RAS er store drivere for ondartet transformasjon i flere menneskelige kreftformer. Blant disse tre RAS-isoformene er onkogene mutasjoner i K-RAS mestutbredte 6,7,8. For at EGFR og RAS skal fungere, må de lokaliseres til plasmamembranen (PM). Forebygging av lokalisering av disse molekylene til statsministeren kan fullstendig avvike den biologiske aktiviteten til denne signalveien9,10. Derfor er hemming av lokaliseringen av disse proteinene til statsministeren en terapeutisk strategi for å blokkere nedstrømssignalering og de resulterende negative resultatene. Ved hjelp av en screeninganalyse med høyt innhold ble fendilin, en L-type kalsiumkanalblokker, identifisert som en hemmer av K-RAS-aktivitet11. Nanoclustering av K-RAS til det indre pakningsvedlegget til PM er betydelig redusert i nærvær av fendilin. Videre omfordeles K-RAS fra plasmamembranen til det endoplasmatiske retikulumet (ER), Golgi-apparatet, endosomer og cytosol. Enda viktigere er at spredningen av bukspyttkjertelen, tykktarmen, lungen og endometriekreftcellelinjene som uttrykker onkogen mutant K-RAS, blokkeres ved hemming av nedstrømssignalering ved fendilin11. Disse dataene antyder at fendilin fungerer som en spesifikk K-RAS anticancer terapeutisk som forårsaker feillokalisering av RAS-proteinet til PM.
Nematoden Caenorhabditis elegans har blitt grundig studert i sammenheng med utvikling. Mange av signalveiene som styrer utviklingen i ormen er evolusjonære og funksjonelt bevart. Egfr-mediert aktivering av RAS og den påfølgende aktiveringen av ERK MAPK-signalkaskaden er for eksempel bevart i ormen12. Kaskaden er representert av følgende proteiner: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 er homolog til RAS, mens LET-23 er homolog til EGFR. I ormen regulerer denne banen utviklingen av vulva13. Vulvaen er en epitelåpning på ormens ventrale kroppsvegg som gjør at befruktede egg kan legges. Dannelsen av vulvaen i ormen er avhengig av eksponeringen av vulvalforløpercellene (VPC) til en gradient av aktivering av EGFR-RAS-MAPK-signalkaskaden. Under den normale utviklingen mottar de proksimale VPCene sterke signaler fra gonadale ankerceller for å skille seg ut i 1 ° og 2 ° celle skjebner som gir opphav til en funksjonell vulva12. Mens distale VPCer skiller seg ut i 3 ° celle skjebner som smelter til hypodermal synkronisering og ikke danner vulva på grunn av utarmet signalering. I mangel av signalering skiller alle VPCer seg til 3 ° celle skjebner som resulterer i dannelsen av ingen vulva. Konstituerende signalering fører imidlertid til dannelsen en eller flere ikke-funksjonelle vulva på grunn av induksjon av alle VPCer for å anta 1 ° og 2 ° celle skjebner.
Mutasjoner som forårsaker defekt eller overdreven vulval induksjon er identifisert for mange av genene som koder for proteiner som representerer denne banen. Defekt vulval induksjon resulterer i en vulvaless (Vul) fenotype, mens overdreven vulval induksjon resulterer i en multivulva (Muv) fenotype som er representert ved utvikling av mange ikke-fungerende ektopiske pseudovulvae gjennom den ventrale kroppsveggen. Muv-fenotypen uttrykt av let-60(n1046)-stammen skyldes en gevinst av funksjonsmutasjon i RAS, mens i let-23 (sa62) stammen skyldes det en aktiverende mutasjon i EGFR14,15. Den sterke Muv-fenotypen i disse mutantstammene har vist seg å være forstyrret av farmakologiske intervensjoner som vist ved behandling av la-60 (n1046) ormer med MEK-1-hemmeren U012616,17. Interessant nok har vi vist at R-fendiline og inhibitorer som påvirker sphingomyelin metabolisme undertrykkeR Muv-fenotypen i ormen18. For å demonstrere disse inhibitorene blokkere let-60 signalering på nivået av RAS, lin-1 null stammen har blitt brukt17. Lin-1 er en Ets-lignende hemmende transkripsjonsfaktor som fungerer som undertrykker i utviklingen av vulva19. Sterk tilbakevending av Muv-fenotypen i la-60(n1046) ormer og ingen effekt på lin-1 null ormer tyder på at disse hemningene forekommer på RAS-nivået.
I denne protokollen demonstrerer vi bruken av C. elegans som modell for å identifisere hemmere av RAS- og EGFR-proteiner. Ved hjelp av en væskebasert analyse demonstrerer vi de hemmende effektene av R-fendilin ved å undertrykke Muv-fenotypene i let-60 (n1046) og la-23 (sa62) mutantstammer av C. elegans. Denne analysen validerer bruken av C. elegans som et verktøy i den første fasen av legemiddeloppdagelse for anticancer terapeutiske behandlinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysene vi beskriver ved hjelp av ormen er enkle og rimelige for å identifisere hemmere av EGFR- og RAS-funksjonen. C. elegans er en attraktiv modell for narkotikaoppdagelse fordi det er lett å vokse i laboratoriet på grunn av den korte livssyklusen (3 dager ved 20 °C) og evnen til å generere et stort antall larver. Enda viktigere er at EGFR-RAS-ERK MAPK-banen er evolusjonært og funksjonelt bevart med pattedyr som gir et genetisk gjennomførbart system for å analysere effekten av EGFR- og RAS-hemmere. V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) for å ha gitt let-60(n1046). Vi takker også Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences &Technology i Houston) for lin-1-stammen. Til slutt takker vi Dr. Danielle Garsin og laboratoriet hennes (University of Texas, McGovern Medical School) for å ha gitt noen av reagensene. Noen ormstammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Denne forskningen ble støttet av Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) grant RP200047 til JF Hancock.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
References
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. 암 연구학. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. 암 연구학. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. 암 연구학. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. 유전학. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
