מדידת פעילות אנטי פטרייתית נדיפה ולא נדיפה של מוצרי ביו-בקרה

Summary

אנו מתארים שיטה מבוססת אגר שונה שנועדה לכמת את ההשפעות האנטי פטרייתיות של מוצרים שמקורם בצמחים. ניתן להעריך הן תרומות תנודתיות והן תרומות לא תנודתיות לפעילות האנטי-פטרייתית באמצעות פרוטוקול זה. בנוסף, ניתן למדוד את היעילות נגד פטריות בשלבים התפתחותיים מרכזיים במערך ניסיוני יחיד.

Abstract

הפרוטוקול המתואר מבוסס על טכניקת העברת פלאג המאפשרת קביעה מדויקת של כמויות מיקרואורגניזם ושלבי ההתפתחות שלהם. מספר מסוים של נבגים מפוזרים על צלחת אגר. צלחת אגר זו דגירה לתקופה מוגדרת כדי לאפשר לפטריות להגיע לשלב ההתפתחותי הצפוי, למעט נבגים שבהם אין צורך בדגירה. תקעי אגר המכוסים בנבגים, היפאי או מיסליום נסוגים ומועברים לאחר מכן למדיית אגר המכילה את התרכובת נגד פטריות להיבדק או ממוקמת במרחק מהפטריות או במגע. שיטה זו ישימה כדי לבדוק הן תמציות נוזלי ודגימות מוצקות (אבקות). היא מתאימה במיוחד לכימות התרומות היחסיות של סוכנים נדיפים ולא נדיפים בתערובות ביו-אקטיביות ולקביעת השפעותיהם, במיוחד על נבגים, היפה מוקדמת ומיסליום.

השיטה רלוונטית מאוד לאפיון הפעילות האנטי פטרייתית של מוצרי ביו-בקרה, בעיקר מוצרים שמקורם בצמחים. ואכן, לטיפול בצמחים, ניתן להשתמש בתוצאות כדי להנחות את הבחירה של מצב היישום ולהקים את סף ההדק.

Introduction

הפסדים גלובליים של פירות וירקות יכולים להגיע עד 50% מהייצור¹ ונבעים בעיקר מריקבון מזון שנגרם על ידי קלקול פטריות בשדה או במהלך אחסון שלאחר הקציר^2,3, למרות התעסוקה הנרחבת של קוטלי פטריות סינתטיים מאז אמצע המאה העשרים⁴. השימוש בחומרים אלה נשקל מחדש שכן הוא מייצג מפגעים סביבתיים ובריאותיים חמורים. כמו ההשלכות המזיקות של השימוש בהם מופיעים ברחבי מערכות אקולוגיות ועדויות של השפעות בריאותיות פוטנציאליות צברה^5,6, חלופות הרומן אסטרטגיות מניעתיות ישנות מפותחים עבור טיפולים לפני ואחרי הקציר^7,8,9. לפיכך האתגר העומד בפנינו הוא כפול. אסטרטגיות פטרייתיות חדשניות חייבות, ראשית, לשמור על רמות היעילות של הגנה על מזון מפני פיטופטוגנים ובוי-זמנית, שנית, לתרום לצמצום דרמטי של טביעת הרגל הסביבתית של שיטות חקלאיות. כדי להגשים מטרה שאפתנית זו, אסטרטגיות בהשראת ההגנות הטבעיות שהתפתחו בצמחים מוצעות כמו יותר מ 1000 מיני צמחים הודגשו עבור תכונות מיקרוביאלית שלהם⁸. לדוגמה, צמחים אשר פיתחו קוטלי פטריות טבעיים להילחם phytopathogens הם משאב חדשני לחקור את הפיתוח של מוצרים חדשים biocontrol². שמנים אתריים הם מולקולות דגל מסוג זה. לדוגמה, שמן אתרי Origanum מגן על צמחי עגבניות מפני עובש אפור בחממות ¹⁰ ו Solidago canadensis L. ושמנים אתריים קאסיה הוכחו לשמר תותים שלאחר שנקטפו מנזק עובש אפור^11,12. דוגמאות אלה ממחישות כי ביו-בקרה ובמיוחד מוצרים שמקורם בצמחים מייצגים פתרון המשלב יעילות ביולוגית וקיימות סביבתית.

לכן, צמחים הם משאב חשוב של מולקולות בעלות עניין פוטנציאלי לתעשיית הגנת היבול. עם זאת רק קומץ של מוצרים צמחיים הוצעו לשמש מוצרים biocontrol למרות שהם מוכרים בדרך כלל בטוח, לא פיטוטוקסי וידידותי לסביבה². כמה קשיים טרנספוזיציה מהמעבדה לשדה נצפו, כגון יעילות פוחתת פעם להחיל vivo^2,9. לכן, חשוב לשפר את היכולת של בדיקות מעבדה כדי לחזות טוב יותר את יעילות השדה. בהקשר זה, שיטות בדיקה נגד פטריות עבור מוצרים שמקורם בצמחים נחוצים הן כדי להעריך את היעילות שלהם נגד פטריות והן כדי להגדיר את התנאים האופטימליים שלהם לשימוש. באופן ספציפי, מוצרי ביו-בקרה הם בדרך כלל פחות יעילים מאשר קוטלי פטריות כימיים, ולכן הבנה טובה יותר של אופן הפעולה שלהם חשובה להצעת ניסוחים מתאימים, לזהות את אופן היישום בשדות, ולהגדיר איזה שלב התפתחותי של הפתוגן פגיע לייצור הביולוגי המועמד.

הגישות הנוכחיות המטפלות בפעילויות אנטיבקטריאליות ונוגדות פטריות כוללות שיטות דיפוזיה כגון דיפוזיה של אגר-דיסק, דילול, ביואוטוגרפיה וציטומטריית זרימה¹³. רוב הטכניקות הללו, וליתר דיוק, בדיקות הרגישות האנטי-פטרייתיות הסטנדרטיות – דיפוזיה של אגר-דיסק ובדיקות דילול – מותאמות היטב להערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של תרכובות מסיסות על נבגים חיידקיים ופטריות בהשעיות נוזליות¹⁴. עם זאת, שיטות אלה אינן מתאימות בדרך כלל לבדיקת תרכובות מוצקות כגון אבקת צמחים מיובשים או לכמת פעילות אנטי פטרייתית במהלך צמיחת mycelium כפי שהם דורשים דילול נבג או נבג מתפשט על צלחות אגר ו / או דילול של תרכובות נגד פטריות¹³. בשיטה מורעלת מזון, צלחות אגר המכילות את הסוכן נגד פטריות מחוסנים עם דיסק בקוטר 5-7 מ”מ שנדגם מתרבות פטריות בת 7 ימים מבלי לקחת בחשבון את הכמות המדויקת של מיסליום מתחיל. לאחר הדגירה, הפעילות נגד פטריות נקבעת כאחוז של עיכוב צמיחה רדיאלית^17,18,19. עם גישה זו אנו יכולים להעריך את הפעילות נגד פטריות על צמיחה mycelial. לעומת זאת, שיטת דילול אגר מבוצעת כדי לקבוע את הפעילות נגד פטריות על נבגים מחוסנים ישירות על פני השטח של צלחת אגר המכילה את תרכובות נגד פטריות^13,20,21. שתי גישות אלה לתת תוצאות משלימות על פעילות נגד פטריות. עם זאת אלה שתי טכניקות עצמאיות המשמשות במקביל שאינן מספקות השוואה מדויקת זה לצד זה של היעילות היחסית של תרכובות אנטי פטרייתיות על נבגים ומיסליום^17,20,22 כמו כמות החומר הפטרייתית ההתחלתית שונה בשתי הגישות. יתר על כן, הפעילות נגד פטריות של מוצר שמקורו בצמחים נובעת לעתים קרובות משילוב של מולקולות אנטי פטרייתיות מסונתז על ידי צמחים להתמודד עם פתוגנים. מולקולות אלה מקיפות חלבונים, פפטידים^23,24ומטבוליטים בעלי מגוון כימי רחב ושייכים לסוגים שונים של מולקולות כגון פוליפנולים, טרפנים, אלקלוואידים²⁵גלוקוסינולטים,⁸ותרכובות אורגנוסולפור,²⁶. חלק ממולקולות אלה הן נדיפות או הופכות נדיפות במהלך התקפת פתוגן²⁷. סוכנים אלה הם לרוב מסיסים במים גרועים ותרכובות בלחץ אדים גבוה שיש לשחזר באמצעות זיקוק מים כמו שמנים אתריים, שחלק מהפעילויות האנטי מיקרוביאליות שלהם הוקמו היטב²⁸. מבחני רגישות מתווכים בשלב האדים פותחו כדי למדוד את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של תרכובות נדיפות לאחר אידוי והגירה דרך שלב האדים²⁹. שיטות אלה מבוססות על כניסתה של תרכובות נגד פטריות במרחק מהתרבות המיקרוביאלית^{29,30,31,32,33}. ב Assay אגר שלב אדים נפוץ, שמנים אתריים מופקדים על דיסק נייר ממוקם במרכז הכיסוי של צלחת פטרי במרחק מן ההשעיה נבג חיידקי או פטרייתי, אשר מתפשט על מדיום אגר. קוטר אזור עיכוב הגדילה נמדד באותו אופן כמו בשיטת הדיפוזיה של אגר-דיסק^20,24. גישות אחרות פותחו כדי לספק מדידה כמותית של הרגישות נגד פטריות שלב האדים של שמנים אתריים, נגזר משיטת דילול המרק שממנה חושבה פעילות מיקרוביאלית מתווכת שלב אדים מעכבת³²או נגזר ממאיורי דיפוזיה של דיסק אגר,³¹. שיטות אלה הן בדרך כלל ספציפיות מחקרי פעילות שלב האדים ולא מתאים למגע עיכוב מבחנים. זה מונע את קביעת התרומה היחסית של סוכנים תנודתיים ולא תנודתיים לפעילות אנטי פטרייתית של תערובת ביו-אקטיבית מורכבת.

השיטה הכמותית שפיתחנו שואפת למדוד את ההשפעה האנטי פטרייתית של אבקת צמחים מיובשים על כמויות מבוקרות של נבגים ומיסליום גדל שהופקד על פני השטח של מדיום אגר כדי לשחזר את הצמיחה האווירית של פיטופטוגנים במהלך זיהום של^{צמחים 15,} כמו גם רשת mycelial מחובר¹⁶. הגישה היא התקנה ניסיונית שונה המבוססת על דילול אגר ושיטות מורעלות מזון המאפשרות גם, באותה התקנה ניסיונית, כימות זה לצד זה של תרומתם של מטבוליטים אנטי נדיפים ולא נדיפים. במחקר זה, השיטה כבר benchmarked נגד הפעילות של שלוש תכשירים אנטי פטרייתיים מאופיינים היטב.

Protocol

1. הכנת אינקולה לפני הניסוי, שכב 5 μL של טריכודרמה spp. נבגי SBT10-2018 המאוחסנים ב-4 °C (60 °F) על מדיום אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) ודגדוג במשך 4 ימים ב 30 מעלות צלזיוס עם חשיפה רגילה לאור כדי לקדם היווצרות conidia42 (איור 1, פאנל A).הערה: טריכודרמה spp. SBT10-2018 מבודד מע…

Representative Results

כדי להעריך את היכולת של השיטה הכמותית להפלות את אופן הפעולה של סוגים שונים של תרכובות נגד פטריות, השווינו את היעילות של שלושה סוכנים ידועים נגד פטריות. Carbendazim הוא קוטל פטריות סינתטי לא נדיף אשר נעשה שימוש נרחב כדי לשלוט במגוון רחב של מחלות פטרייתיות בצמחים39,40</su…

Discussion

הגישה המוצגת כאן מאפשרת הערכה של תכונות אנטי פטרייתיות של מוצרים צמחיים מעובדים מינימלית. בפרוטוקול זה, התפלגות הומוגנית של נבגים על פני השטח אגר מושגת באמצעות חרוזי זכוכית 2 מ”מ. שלב זה דורש טיפול במיומנויות כדי להפיץ כראוי את החרוזים כדי להשיג תוצאות לשחזור, בסופו של דבר המאפשר השוואה של …

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/