Denne protokol beskriver en enkel metode til at dyrke tredimensionelle rekonstituerede menneskelige epidermis i en reproducerbar og robust måde. Derudover karakteriserer det strukturfunktionsforholdet mellem den epidermale barrieremodel. De biologiske reaktioner fra den rekonstituerede menneskelige epidermis på proinflammatoriske stimuli præsenteres også.
En tre-dimensionel menneskelige epidermis model rekonstrueret fra neonatal primære keratinocytter præsenteres. Heri beskrives en protokol for dyrkningsprocessen og karakteriseringen af modellen. Neonatal primære keratinocytter dyrkes nedsænket på gennemtrængelige polycarbonatindsatser og løftes til den luftvæskegrænseflade tre dage efter såning. Efter fjorten dages stimulering med definerede vækstfaktorer og ascorbinsyre i høj calciumkulturmedium er modellen fuldt differentieret. Histologiske analyser afslørede en fuldstændig stratificeret epidermis, der efterligner morfologien af indfødt menneskelig hud. For at karakterisere modellen og dens barrierefunktioner blev proteinniveauer og lokaliseringsspecifikke for tidlig keratinocytdifferentiering (dvs. keratin 10), sen differentiering (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) og vævslimemiddel (dvs. desmoglein 1) vurderet ved immunfluorescens. Vævsbarrierens integritet blev yderligere evalueret ved at måle transepithelial elektrisk modstand. Røkonstructed human epidermis var lydhør over for proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysaccharid og tumor nekrose faktor alpha), fører til øget cytokin frigivelse (dvs. interleukin 1 alfa og interleukin 8). Denne protokol repræsenterer en enkel og reproducerbar in vitro-metode til dyrkning af rekonstrueret human epidermis som et redskab til at vurdere miljøvirkninger og en bred vifte af hudrelaterede undersøgelser.
Epidermis er det yderste lag af huden, på den direkte grænseflade mellem menneskekroppen og det ydre miljø. Dens vigtigste funktioner er at yde beskyttelse og hydrering1. Epidermis fungerer som en effektiv fysisk barriere mod eksterne agenter og forhindrer overdrevent vandtab fra kroppen. Disse hudfunktioner afhænger hovedsageligt af det cellulære arrangement i de yderste lag af huden, sammensætningen og organiseringen af intercellulære lipider2. Epidermis består primært af keratinocytter, der migrerer opad til den ydre side af vævet og gennemgår differentiering. Der er 4-5 epidermale lag, der er kendetegnet ved deres differentieringsstadium. Fra indersiden til ydersiden starter de epidermale lag fra den levedygtige epidermis,dvs. Det basale lag består hovedsageligt af formerende keratinberigede keratinocytter, som migrerer gennem SS ved differentiering4. Under keratinocytmodning sker forskellige ændringer i proteinudtryk og struktur. Keratinocytter klæber gennem dannelsen af desmosomale vejkryds5. I SG, er generationen af lamellar organer indledt. De består af lipidprækursorer og enzymer, der er afgørende for dannelsen af hudbarrierefunktionen6. SG er også kendetegnet ved tilstedeværelsen af keratohyalin granulat i keratinocytternes cytoplasma. Ved grænsefladen med SC, indholdet af lamellar organer er ekstruderet ind i intercellulære rum og ikke-polære lipider såsom ceramider, kolesterol, og frie fedtsyrer organisere i stablet lamellar lipid bilayers at danne ekstracellulære lipid matrix7. I SC mister celler alle cellulære organeller, herunder kernen, på grund af enzymatiske nedbrydningsprocesser og vedtager en flad morfologi. De er omgivet af en cornified kuvert lavet af krydsbundet protein lag, og kaldes corneocytes8,9. Desmosomale komponenter er krydsbundet med den cornified kuvert til at danne corneodesmosomes og binde corneocytes sammen. Det resulterende epitel fornyes løbende fra stamceller med en omsætningstid på ca. 5-6 uger10. Differentieringsprocessen af keratinocytterne, som resulterer i en fuldt stratificeret epidermis, er afgørende for dannelsen af hudensbarrierefunktion 11.
Under sår og betændelse fremkalder keratinocytter ændringer i vedhæftningsmolekyler og overfladereceptorer og udløser proinflammatoriske reaktioner via sekretion af cytokiner, kemokiner og antimikrobielle peptider12. Huden er ikke kun en fysisk barriere mod udefrakommende stoffer; det fungerer også som immunsensor ved udsættelse for patogener. Derudover regulerer det udbredelsen af flere stoffer på tværs af dets lag, såsom vandindhold for at beskytte menneskekroppen mod dehydrering. Huden er også involveret i syntesen af D-vitamin og har forskellige andre metaboliske funktioner3,13,14.
For at vurdere de skadelige virkninger af eksogene stoffer har toksikologer i årtier været afhængige af dyreforsøg, men i dag er det ikke den foretrukne tilgang. Ud over at have begrænset prædiktiv kapacitet til menneskelig toksicitet involverer dyremodeller adskillige etiske spørgsmål. Forbuddet mod dyreforsøg i kosmetikindustrien og henstillingen om at følge 3R-princippet (dvs. udskiftning, reduktion og raffinement) inden for forskning har ført til udvikling af alternative testmetoder baseret på in vitro-tilgange15. De første in vitro hudcellemodeller er allerede beskrevet i 90’erne, og en imponerende udvikling fra enkle menneskelige keratinocyte monokulturer til fuldt differentierede epidermis og modeller i fuld tykkelse er opnået16. I dag har hudvævsteknik fået betydning på både det farmaceutiske og dermato-kosmetiske område. I de sidste to årtier har flere virksomheder kommercialiseret tredimensionelle (3D) rekonstruerede menneskelige epidermis (RhE), der repræsenterer standardiserede og reproducerbare værktøjer til hudrelaterede undersøgelser. Flere kommercielle RhE-modeller accepteres til in vitro-hudtest af kemikalier i henhold til OECD’s retningslinjer for testning af hudirritation17,18 (dvs. testretningslinje 43919) og hudkorrosion20 (dvs. testretningslinje 43121). In vitro-testen for hudsensibilisering22 (dvs. SENS-IS-analyse) er i øjeblikket i godkendelsessporet og under peer-review23. Der er også mange andre assays udviklet, der bruger kommercielle RhE-modeller til at evaluere fototoksicitet24, for at teste lægemiddelformuleringer25, kosmetiske formuleringer og aktive ingredienser26, for at studere hudbarrierefunktionen27 og for at teste den biologiske reaktion på miljøstressorer28,29,30,31.
Ud over kommercielt tilgængelige 3D-hudmodeller har flere forskningsgrupper udviklet deres egne RhEs32,33,34,35,36,37. Interne RhEs giver den fordel, at de kontrollerer kulturforholdene i henhold til formålet med undersøgelsen. Specifikt kan forskere vælge typen og kilden til keratinocytterne, der skal bruges til rekonstituering af deres 3D epidermale model (dvs. primær vs udødeliggjort, neonatal vs. alderen, enkelt vs. samlet tilfældige donorer, køn, etnicitet, individuelle levende vaner som rygning osv.). De har mulighed for at variere sammensætningen af kulturmediet og indarbejde vækstfaktorer, vitaminer eller andre forbindelser, der kan modulere ekspressionen af målproteiner eller lipider. Med in-house RhEs kan forskere også undersøge biologiske reaktioner og biomekaniske egenskaber som en funktion af 3D-modellens differentieringstilstand. Ud over disse intuitive parametre er der løbende bestræbelser på at øge kompleksiteten af 3D-hudmodeller og gøre dem mere fysiologisk relevante, f.eks . ved at tilføje andre epidermale celletyper (f.eks. melanocytter og immunceller)38,39, ved at dyrke keratinocytterne oven på en fibroblastbefolket kollagenmatrix40,41,42og ved at inkludere komponenter i det vaskulære netværk43,44,45.
Selv om det er muligt at tune kulturforholdene efter specifikke behov, er der parametre, der skal overholdes for at garantere både kvaliteten og relevansen af en RhE. For at dyrke RhE-væv sås normale humane epidermale keratinocytter (NHEG’er) i specifikke gennemtrængelige dyrkningsindsatser, hvis porøse syntetiske membran adskiller brøndene i to rum, dvs. det apikale og basolaterale rum. Membranens porøsitet (dvs. en porestørrelse på 0,4 μm) er sådan, at den gør det muligt at danne en cellemonomer i det apikale rum uden migration af celler til den basale skærside og fodring af keratinocytterne med essentielle næringsstoffer fra kulturmediet indeholdt i basolateralrummet. I begyndelsen af rekonstitutionsprocessen dyrkes NHEKs under nedsænkede forhold i et par dage for at tillade deres vedhæftning på membranen. Calciumniveauet i begge rum øges i forhold til den calciumkoncentration, der anvendes til NHEKs 2D-dyrkning for at bremse spredningen af celler og i stedet fremme deres differentiering46. En epidermal calciumgradient er afgørende for at regulere barrieredannelsen og homøostase47,48. Høje calciumniveauer (dvs. op til 1,5 mM) fremmer dannelsen af intercellulære vejkryds og modulerer dannelsen af den cornified kuvert under terminal differentiering49. Når keratinocytter danner et kontinuerligt og tæt klæbende monolag på støttemembranen, fjernes mediet fra det apikale rum, og kulturprocessen fortsætter ved den luftvæskegrænseflade (ALI) for at stimulere stratificeringen og etablere en epidermalbarriere 50,51. Særlige kulturforhold er afgørende for at opnå et fuldt stratificeret epitel36. Under rekonstitutionsprocessen hos ALI suppleres mediet i basolateralrummet med keratinocytvækstfaktor (KGF), insulin, calcium og ascorbinsyre. Ascorbinsyre spiller en stor rolle i dannelsen af en passende SC lipid barriere, der ligner den indfødte menneskelige hud52. Keratinocytter dyrket i ascorbinsyre-suppleret medium demonstrere en differentieret fænotype, med et øget antal keratohyalin granulat, samt organiseret intercellulær lipid lamellae i interstices af corneocytes52. En sådan tilskud er afgørende for at forbedre epidermal barriere funktion ved at øge cornified kuvert indhold og undgå udtømning af hydrofile antioxidant butikker53,54. KGF, en vigtig parakrine mægler af epidermal spredning og differentiering, bruges til at stimulere NHEKs55.
De vigtigste ulemper ved interne RHE’er omfatter tab af standardisering mellem forskningsinstitutioner og øget arbejdsintensitet og tidsforbrug (op til 3 uger sammenlignet med de færdige kommercielle modeller). Formålet med dette dokument er at afhjælpe disse ulemper og skabe grundlag for produktionen i større målestok. Ud over ovennævnte fordele ved interne RHE’er har den nuværende protokol til formål at reducere intra- og intervariationen blandt væv, reducere forureningsrisici og strømline dyrkningsprocessen.
Den nuværende protokol beskriver en reproducerbar og robust metode til at dyrke RhEs ved hjælp af neonatal NHEKs. Desuden viser det repræsentative resultater af karakteriseringen af RhEs morfologi, barriereintegritet og udtryk for proteiner, der er specifikke for epidermal differentiering. RhEs morfologiske struktur blev undersøgt ved hjælp af hematoxylin og eosin (H &E) farvning og transmission elektron mikroskopi (TEM). For at vurdere barrierens integritet blev den transepidermale elektriske modstand (TEER) og eksponeringstiden for Triton X-100 for at reducere 50% af vævs levedygtigheden (ET50) målt. Dannelsen af desmosomale vejkryds (dvs. desmoglein 1) blev analyseret af immunfluorescens (IF) for at evaluere keratinocyte vedhæftning. Dannelsen af epidermale strukturelle proteiner (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) blev evalueret og påvist med IF. Disse proteiner er involveret i dannelsen af den stærkt krydsbundet proteinkonvolut , der omgiver SC-corneocytter , og som følge heraf er vigtige markører for sen-fase epidermal differentiering56,57. Derudover blev IF brugt til at analysere keratin 10, et protein induceret i tidlige fase differentierede celler i SS58 og fundet inde i alle differentierede lag. Endelig rhe’s reaktion på proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysaccharid og tumor nekrose faktor alpha) blev undersøgt. Niveauerne af interleukin 1 alpha (IL-1α) og interleukin 8 (IL-8) blev målt i cellekulturmedierne ved hjælp af enzymforbundne immunosorbentanalyser (ELISA).
RhEs er meget udbredt som screening værktøjer i den farmaceutiske og dermato-kosmetiske felter36,75,76,77,78. Selv om flere virksomheder har stillet sådanne rhes kommercielt tilgængelige, forbliver de dyre og begrænser muligheden for at variere dyrkningsparametrene efter behov for at behandle nye forskningsspørgsmål. Dette papir beskriver produktionsproceduren for interne RHE’er på en robust og pålidelig måde og giver en detaljeret karakterisering af de opnåede væv for at bekræfte modellens relevans som en alternativ tilgang til dyreforsøg.
Nogle af trinene i protokollen er afgørende for at sikre korrekt keratinocyt differentiering og RhE reproducerbarhed. Dette kan gøres ved at udnytte de optimale celler, mellemstore typer og dyrkningsforhold. I den foreslåede RhE-model blev neonatal NHEKs udvalgt på grund af deres manglende antigene eksponering sammenlignet med voksne NHEKs. Desuden var keratinocytter begrænset til kaukasisk etnicitet for at undgå variabilitet mellem arter. Primære keratinocytter bruges typisk til deres evne til at differentiere og stratificere79. De kan fås kommercielt eller ved intern isolering fra voksen hud80. Dyrkningen af en cellelinje (dvs. HaCaT) på en polycarbonatmembran har vist sig at mislykkes differentiering og vist en nedsat evne til at syntetisere lipider, der er nødvendige for barrieredannelse81. Men inddragelsen af forskellige kultur matricer, såsom hydrogels, kollagen, fibrin, og sfæroider kulturer, resulterede i en vellykket udvikling af 3D hudmodeller78,82,83,84,85,86. De udødeliggjorte cellelinjer, N/TERT, har vist sig at være egnede til udvikling af rhes35. Primære keratinocytter forbliver proliferative på deres fjerde eller femte passage61, derfor omfatter den nuværende protokol brugen af keratinocytter i deres tredje passage. De Vuyst et al. har påvist, at cellesåningstætheden er vigtig og skal være tilstrækkelig (dvs. ≥ 2,5 x 105 celler/cm2) for at sikre, at mediet fra basolateralrummet ikke spredes til det apikale rum. En utilstrækkelig såningstæthed (dvs. < 2.5×105 celler/cm2) kan resultere i en manglende evne til at danne en ordentlig barriere, hvilket indikeres af udbredelsen af medium fra basolateral til det apikale rum, hvilket resulterer i nedsænket i stedet for ALI-dyrkningsforhold62. Serumfrit keratinocytvækstmedium (se Tabel over materialer) blev foretrukket til reproducerbarhedsformål, da det giver den fordel, at det arbejder med et kemisk defineret medium og reducerer risikoen for kontaminering. Dette medium har en lavere calciumkoncentration (dvs. 60 μM) og stimulerer derfor spredningen af keratinocytter87. Forøgelse af calciumkoncentrationen (dvs. 1,5 mM) fra det første trin i RhE-dyrkningen, favoriserer keratinocyt differentiering og hudbarrieredannelse og homøostase49. Derudover suppleres ALI-mediet med ascorbinsyre, som har vist sig at være afgørende for dannelsen af SC-lipider og for at fremme differentiering52,53,54. ALI-mediet indeholder også KGF, som er en vækstfaktor udskilt af fibroblaster, der kan binde sig til keratinocyt transmembrane receptorer og ved aktivering har en dobbelt rolle i differentiering og sårreparation55,88. Det er vigtigt at opdatere ALI-mediet med bestemte tidsintervaller for at give en konstant forsyning af friske næringsstoffer til RhEs. Brugen af et bærepladesystem er afgørende for RhE-dyrkning i større skala (dvs. 24 skær/plade). Det giver den fordel at spare tid, reducere risikoen for forurening, og giver mindre plads til indførelsen af menneskelige fejl. Det giver også mulighed for at dyrke rhes i en stor mængde medier (dvs. 1,5 mL), hvilket reducerer det nødvendige antal ALI-medium refreshes. Derudover giver det mulighed for at overføre en fuld plade af skær til en plade med frisk medium, undgå kontakt med indsatserne individuelt eller afdække pladelåget.
Der er flere begrænsninger af RhE-modellen, der skal bemærkes. I den oprindelige menneskelige hud er der en balance mellem spredningen af keratinocytter i det basale lag og løsrivelsen af corneocytter i SC (dvs. desquamation)89. Men in vitro, desquamation finder ikke sted. Derfor forbliver corneocytterne fastgjort til RhE og danner en tyk SC, der er mindre fysiologisk relevant. Derfor er der en begrænset dyrkningstid for RhEs. Desuden er denne RhE-model enkel og ligetil, da den består af en enkelt celletype, dvs. keratinocytten, som er den mest rigelige celletype af epidermis. Der er dog andre celletyper bosiddende i epidermis, såsom melanocytter, dendritiske celler (dvs. Langerhans celler), T-celler (f.eks.+ celler) og Merkel-celler13. For at forbedre hudmodellens fysiologiske relevans har forskere gjort hudmodeller mere komplekse ved at tilføje melanocytter38 , immunceller39eller celler afledt af patienter90. Man bør huske på, at barrieren egenskaber menneskelige hudmodeller er forskellige i forhold til indfødte menneskelige hud, på grund af især en anden SC lipid sammensætning og en højere barriere permeabilitet 91,92,93,94,95. Flere undersøgelser har imidlertid rapporteret om ændringer i barriereegenskaberne for menneskelige hudmodeller ved dyrkning under hypoxi96 eller nedsat relativ luftfugtighed97, gradueringen af den dermale matrix med chitosan98, og ændring af de frie fedtsyrer i kulturmediet99. Desuden kan kulturforholdene og den mellemstore sammensætning i både enkle og mere komplekse RhEs moduleres for at efterligne patologiske træk. Ved at udfordre modellen med cytokiner, en unormal morfologi100 og ændringer i gen- og proteinudtryksniveauer kan fastslås, som typisk observeres i almindelige hudlidelser, såsom atopisk dermatitis og psoriasis35,101,102,103,104,105. Lyddæmpning af specifikke gener i keratinocytter, før du påbegynder rekonstitutionsprocessen for 3D-modellen, er en anden tilgang, der bruges til at efterligne træk ved hudlidelser og undersøge nye terapeutiske løsninger106,107. Ud over kun modellering af et epidermalt lag kan et dermalt rum indgå i modellen (dvs. navngivne menneskelige hudækvivalenter eller modeller med fuld tykkelse) ved at integrere fibroblaster i en kollagenmatrix før RhE-rekonstitution, hvilket gør det mere fysiologisk relevant og egnet til aldrings- og sårhelingsrelaterede undersøgelser108,109,110. Derudover er tumorspærreoider blevet føjet til menneskelige hudækvivalenter for at studere melanom progression111,112. De seneste fremskridt inden for hudmodeller er biotryk og hud-på-en-chip. Flere forskergrupper har for nylig formået at udvikle (perfusable) bio-trykte hudækvivalenter45,113,114. Den foreslåede protokol udnytter et 24-brønds format og en bæreplade og undgår skær, der skal håndteres individuelt. Undersøgelsesskalaen er dog stadig ret begrænset og mangler automatisering. Ved at implementere brugen af biotryk eller hud-på-en-chip kan mindre hudmodeller bruges med mere automatiserede processer og i større skala.
RhE beskrevet i denne protokol har flere ligheder med de allerede udviklede og velkaraktererede kommercielle epidermale modeller. Den morfologiske analyse har vist, at selv om antallet af levedygtige lag i den foreslåede RhE-model er lavere end for indfødt human hud (dvs. 6-7 sammenlignet med 7-14), kan det sammenlignes med EpiDerm RhE-modellen (dvs. 8-12)70. På samme måde som EpiDerm-, EpiSkin- og SkinEthic-modellerne viser det øverste RhE-lag et kurvvævningsmønster af tætpakkede corneocytelag28. Desuden viste TEM-analysen, at antallet af SC-lag i den foreslåede RhE-model (dvs. 15-25) kan sammenlignes med Antallet af EpiDerm (dvs. 16-25)70. Samlet set viser den foreslåede RhE-model en lignende struktur som andre kommercialiserede epidermale modeller, der efterligner den indfødte menneskelige epidermis. Vævsintegriteten målt ved TEER er inden for rækkevidde med kommercielle RhE-modeller (dvs. mellem 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 og andre interne rhes (dvs. ca. 5000 Ω,cm2)74,115. Den foreslåede RhE-model viser sig at være godt differentieret, som det fremgår af tilstedeværelsen og den korrekte lokalisering af differentierings- og vævs vedhæftningsmarkører. Desuden viser den foreslåede RhE-model sig at være lydhør over for proinflammatoriske stimuli (dvs. LPS og TNF-α).
Afslutningsvis vil jeg sige, at den nuværende protokol viser, hvordan rhes kan produceres på en pålidelig måde og i relativt stor skala for at imødekomme forskernes behov i både akademiske og private institutioner. Den foreslåede RhE model viser sig at have lignende morfologi, epidermal differentiering, og biologisk lydhørhed over for andre eksisterende kommercielle modeller. Det giver et alternativt værktøj til både det farmaceutiske og dermato-kosmetiske område, når adgang til en relevant hudmodel er påkrævet.
The authors have nothing to disclose.
EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddet med tilskudsaftalen nr. 765602 finansieret dette arbejde. Alle forfattere anerkender støtte fra Adolphe Merkle Foundation og University of Ferrara og taknemmeligt anerkende Dow Silikone Belgien. Dr. Miguel Spuch-Calvar er anerkendt for at forberede de grafiske billeder af RhE dyrkningsprocessen. Forfatterne takker Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati, og Dr. Agnès Tessier for deres tekniske støtte og diskussioner.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |