Detta protokoll beskriver en enkel metod för att odla tredimensionella rekonstituerade mänskliga epidermis på ett reproducerbart och robust sätt. Dessutom karakteriserar det struktur-funktionsförhållandet för den epidermala barriärmodellen. De biologiska svaren från den rekonstituerade mänskliga epidermis på proinflammatory stimuli presenteras också.
En tredimensionell mänskliga epidermis modell rekonstrueras från neonatal primära keratinocyter presenteras. Häri beskrivs ett protokoll för odlingsprocessen och karakteriseringen av modellen. Neonatal primära keratinocyter odlas nedsänkt på genomsläppliga polykarbonatinsatser och lyfts till luft-flytande gränssnittet tre dagar efter sådd. Efter fjorton dagars stimulering med definierade tillväxtfaktorer och askorbinsyra i högt kalciumkulturmedium är modellen helt differentierad. Histologiska analys visade en helt stratifierad epidermis, härma morfologi av inhemska mänskliga huden. För att karakterisera modellen och dess barriärfunktioner, proteinnivåer och lokalisering som är specifika för tidig keratinocyt differentiering (dvs. keratin 10), sen differentiering (dvs. involucrin, loricrin och filaggrin) och vävnad vidhäftning (dvs. desmoglein 1), bedömdes av immunofluorescens. Vävnad barriär integritet utvärderades ytterligare genom mätning av transepithelial elektrisk resistans. Rekonstruerad human epidermis var lyhörd för proinflammatory stimuli (dvs lipopolysackarid och tumör nekros faktor alfa), vilket leder till ökad cytokin release (dvs interleukin 1 alfa och interleukin 8). Detta protokoll representerar en enkel och reproducerbar in vitro-metod för att odla rekonstruerad mänsklig epidermis som ett verktyg för att bedöma miljöeffekter och ett brett spektrum av hudrelaterade studier.
Epidermis är det yttersta lagret av huden, vid det direkta gränssnittet mellan människokroppen och den yttre miljön. Dess huvudfunktioner är att ge skydd och hydrering1. Epidermis fungerar som en effektiv fysisk barriär mot yttre medel och förhindrar överdriven vattenförlust från kroppen. Dessa hudfunktioner beror främst på det cellulära arrangemanget i de yttersta lagren av huden, kompositionen och organisationen av intercellulära lipider2. Epidermis består främst av keratinocyter som migrerar uppåt till utsidan av vävnaden och genomgår differentiering. Det finns 4-5 epidermala lager som kännetecknas av deras differentieringsstadium. Från insidan till utsidan börjar epidermalla skikten från den livskraftiga epidermis, dvs stratumbasale (SB), stratum spinosum (SS) och stratum granulosum (SG), till det icke-livskraftiga översta skiktet, dvs stratum corneum (SC)3. Det basala skiktet består huvudsakligen av prolifererande keratinberikade keratinocyter, som migrerar genom SS vid differentiering4. Under keratinocyte mognad uppstår olika förändringar i proteinuttryck och struktur. Keratinocyter klibbar sig genom bildandet av desmosomala korsningar5. I SG initieras genereringen av lamellära kroppar. De består av lipidprekursorer och enzymer som är avgörande för bildandet av hudbarriärfunktionen6. SG kännetecknas också av närvaron av keratohyalingranulat i keratinocyternas cytoplasma. Vid gränssnittet med SC extruderas innehållet i de lamellära kropparna i de intercellulära utrymmena och de icke-polära lipiderna som ceramider, kolesterol och fria fettsyror organiserar sig i staplade lamellära lipid bilayers för att bilda den extracelluläralipidmatrisen 7. I SC förlorar cellerna alla cellulära organeller inklusive kärnan, på grund av enzymatiska nedbrytningsprocesser och antar en tillplattad morfologi. De är omgivna av ett cornified kuvert av korslänkade proteinskikt, och kallas corneocytes8,9. Desmosomal komponenter är korslänkade till cornified kuvertet för att bilda corneodesmosomes och binda hornhinnansocyter tillsammans. Det resulterande epitel förnyas kontinuerligt från stamceller, med en omsättningstid på cirka 5-6 veckor10. Differentieringsprocessen för keratinocyterna, som resulterar i en helt stratifierad epidermis, är avgörande för bildandet av hudens barriärfunktion11.
Under sårning och inflammation inducerar keratinocyter förändringar i vidhäftningsmolekyler och ytreceptorer och utlöser proinflammatoriska svar via utsöndring av cytokiner, kemokiner och antimikrobiella peptider12. Huden är inte bara en fysisk barriär mot exogena ämnen; Det fungerar också som en immunsensor vid exponering för patogener. Dessutom reglerar det diffusionen av flera ämnen över sina lager, såsom vatteninnehåll för att skydda människokroppen från uttorkning. Huden är också involverad i syntesen av D-vitamin och har olika andra metaboliska funktioner3,13,14.
För att bedöma de negativa effekterna av exogena ämnen har toxikologer i årtionden förlitat sig på djurförsök, men idag är det inte det föredragna tillvägagångssättet. Förutom att ha begränsad prediktiv kapacitet för mänsklig toxicitet, involverar djurmodeller många etiska frågor. Förbudet mot djurförsök inom kosmetikaindustrin och rekommendationen att följa 3R-principen (dvs. ersättning, minskning och förfining) inom forskningen har lett till utveckling av alternativa testmetoder baserade på in vitro-metoder15. De första in vitro hudcellsmodellerna har redan beskrivits på 90-talet, och en imponerande utveckling från enkla mänskliga keratinocyte monokulturer till helt differentierade epidermis och fulltjockleksmodeller har uppnåtts16. Numera har hudvävnadsteknik fått betydelse inom både läkemedels- och dermato-kosmetiska områden. Under de senaste två decennierna har flera företag kommersialiserat tredimensionella (3D) rekonstruerade mänskliga epidermis (RhE) som representerar standardiserade och reproducerbara verktyg för hudrelaterade studier. Flera kommersiella RhE-modeller godtas för in vitro-hudtestning av kemikalier i enlighet med OECD:s riktlinjer för testning av hudirritation17,18 (dvs. testriktlinje 43919) och hudkorrosion20 (dvs. testriktlinje 43121). In vitro-testet för hudsensibilisering22 (dvs. SENS-IS-analys) är för närvarande i godkännandespåret och under peer-review23. Det finns också många andra analyser utvecklade som använder kommersiella RhE-modeller, för att utvärdera fototoxicitet24, för att testa läkemedelsformuleringar25, kosmetiska formuleringar ochaktiva ingredienser 26, för att studera hudbarriärfunktionen27 och för att testa det biologiska svaret på miljöstressorer28,29,30,31.
Förutom kommersiellt tillgängliga 3D-hudmodeller har flera forskargrupper utvecklat sina egna RhEs32,33,34,35,36,37. Interna rhes erbjuder fördelen för att kontrollera kulturförhållandena enligt syftet med studien. Specifikt kan forskare välja typ och källa till de keratinocyter som ska användas för rekonstitution av deras 3D epidermala modell (dvs. primär kontra odödlig, neonatal kontra åldrad, singel vs. poolade slumpmässiga givare, kön, etnicitet, individuella levnadsvanor som rökning, etc.). De har möjlighet att variera sammansättningen av odlingsmediet och införliva tillväxtfaktorer, vitaminer eller andra föreningar som kan modulera uttrycket av målproteiner eller lipider. Med interna rhes kan forskare också undersöka biologiska svar och biomekaniska egenskaper som en funktion av differentieringstillståndet för 3D-modellen. Förutom dessa intuitiva parametrar finns det kontinuerliga ansträngningar för att öka komplexiteten hos 3D-hudmodeller och göra dem mer fysiologiskt relevanta, till exempel genom att lägga till andra epidermala celltyper (t.ex. melanocyter och immunceller)38,39, genom att odla keratinocyterna ovanpå en fibroblastbefolkad kollagenmatris40,41,42, och genom att inkludera komponenter i kärlnätverket43,44,45.
Även om det är möjligt att anpassa kulturvillkoren efter specifika behov finns det parametrar som måste respekteras för att garantera både kvaliteten och relevansen av en RhE. För att odla RhE-vävnader sås normala humana epidermala keratinocyter (NHEKs) i specifika genomsläppliga odlingsinsatser vars porösa syntetiska membran separerar brunnarna i två fack, dvs. det apatiska och basolaterala facket. Membranets porositet (dvs. en porstorlek på 0,4 μm) är sådan att det gör det möjligt att bilda ett cellmonoskikt i det apatiska utrymmet utan att cellerna förs till den basala insatssidan och utfodring av keratinocyterna med väsentliga näringsämnen från odlingsmediet i det basolaterala utrymmet. I början av rekonstitutionsprocessen odlas NHEKs under nedsänkta förhållanden i några dagar för att tillåta deras vidhäftning på membranet. Kalciumnivån i båda avdelningarna ökas jämfört med kalciumkoncentrationen som används för NHEKs 2D-kultur för att bromsa spridningen av celler och istället främja deras differentiering46. En epidermal kalciumgradient är nödvändig för att reglera barriärbildningen och homeostas47,48. Höga kalciumnivåer (dvs. upp till 1,5 mM) främjar bildandet av intercellulära korsningar och modulerar bildandet av det cornifierade kuvertet under terminal differentiering49. När keratinocyter bildar ett kontinuerligt och tätt vidhäftande monoskikt på det stödjande membranet avlägsnas mediet från det apatiska facket och odlingsprocessen fortsätter vid det luft-flytande gränssnittet (ALI) för att stimulera stratifiering och upprätta en epidermalbarriär 50,51. Särskilda odlingsförhållanden är avgörande för att få ett fullständigt stratifierat epitel36. Under rekonstitutionsprocessen vid ALI kompletteras mediet i det basolaterala utrymmet med keratinocyttillväxtfaktor (KGF), insulin, kalcium och askorbinsyra. Askorbinsyra spelar en viktig roll i bildandet av en lämplig SC lipidbarriär, som nära liknar den inhemska mänskliga huden52. Keratinocyter odlade i askorbinsyra-kompletterat medium visar en differentierad fenotyp, med ett förbättrat antal keratohyalin granulat, samt organiserade intercellulära lipid lameller i interstices av corneocytes52. Sådan tillskott är viktigt för att förbättra epidermal barriär funktion genom att öka cornified kuvert innehåll och undvika utarmning av hydrofil antioxidant butiker53,54. KGF, en viktig parakrina medlare av epidermal spridning och differentiering, används för att stimulera NHEKs55.
De viktigaste nackdelarna med interna rhes inkluderar förlusten av standardisering mellan forskningsinstitutioner och ökad arbetsintensitet och tidsförbrukning (upp till 3 veckor jämfört med de färdiga kommersiella modellerna). Syftet med detta dokument är att ta itu med dessa nackdelar och lägga grunden för produktionen i större skala. Förutom de ovan nämnda fördelarna med interna rhes syftar det nuvarande protokollet till att minska intra- och variabiliteten mellan vävnader, minska föroreningsriskerna och effektivisera odlingsprocessen.
Det nuvarande protokollet beskriver en reproducerbar och robust metod för att odla rhes med neonatal NHEKs. Dessutom visar det representativa resultat av karakteriseringen av RhEs morfologi, barriärintegritet och uttryck av proteiner som är specifika för epidermal differentiering. RhEs morfologiska struktur undersöktes med hematoxylin och eosin (H&E) färgning och överföring elektronmikroskopi (TEM). För att utvärdera barriärintegriteten mättes det transepidermala elektriska motståndet (TEER) och exponeringstiden för Triton X-100 för att minska 50% av vävnadens livskraft (ET50). Bildandet av desmosomal korsningar (dvs. desmoglein 1) analyserades av immunofluorescence (IF) att utvärdera keratinocyte vidhäftning. Bildandet av epidermala strukturella proteiner (dvs involucrin, loricrin och filaggrin) utvärderades och upptäcktes med IF. Dessa proteiner är involverade i bildandet av det mycket korslänkade proteinhöljet som omger SC-hornhinnor och som ett resultat är viktiga markörer för sen epidermal differentiering56,57. Dessutom användes IF för att analysera keratin 10, ett protein inducerat i tidiga fasen differentierade celler i SS58 och hittades inuti alla differentierade lager. Slutligen undersöktes RhE: s svar på proinflammatory stimuli (dvs lipopolysackarid och tumör nekros faktor alfa). Nivåerna av interleukin 1 alfa (IL-1α) och interleukin 8 (IL-8) mättes i cellkulturmedierna med enzymkopplade immunosorbenta analyser (ELISA).
RhEs används ofta som screeningverktyg inom de farmaceutiska och dermato-kosmetiskafälten 36,75,76,77,78. Även om flera företag har gjort sådana rhes kommersiellt tillgängliga, förblir de kostsamma och begränsar möjligheten att variera odlingsparametrarna efter behov för att ta itu med nya forskningsfrågor. Detta dokument beskriver produktionsförfarandet för interna rhes på ett robust och tillförlitligt sätt och ger en detaljerad karakterisering av de erhållna vävnaderna för att bekräfta modellens relevans som ett alternativt tillvägagångssätt för djurförsök.
Några av stegen i protokollet är avgörande för att säkerställa korrekt keratinocyte differentiering och RhE reproducerbarhet. Detta kan utföras genom att använda optimala celler, medelstora typer och odlingsförhållanden. I den föreslagna RhE-modellen valdes neonatal NHEKs för deras brist på antigen exponering, jämfört med vuxna NHEKs. Keratinocyter begränsades dessutom till kaukasisk etnicitet för att undvika variation mellan arter. Primära keratinocyter används vanligtvis för deras förmåga att differentiera och stratifiera79. De kan erhållas kommersiellt eller genom in-house isolering från vuxen hud80. Odlingen av en cellinje (dvs. HaCaT) på ett polykarbonatmembran har visat sig misslyckas med differentiering och visat en nedsatt förmåga att syntetisera lipider som är nödvändiga för barriärbildning81. Införandet av olika kulturmatriser, såsom hydrogeler, kollagen, fibrin och sfäroidkulturer, resulterade dock i en framgångsrik utveckling av 3D-hudmodeller78,82,83,84,85,86. De odödliga cellinjerna, N/TERT, har visat sig vara lämpliga för utveckling av rhes35. Primära keratinocyter förblir proliferativa vid sin fjärde eller femte passage61, omfattar det nuvarande protokollet användningen av keratinocyter i sin tredje passage. De Vuyst m.fl. har visat att cellens såddtäthet är av betydelse och måste vara tillräcklig (dvs. ≥ 2,5×105 celler/cm2) för att säkerställa att mediet från det basolaterala utrymmet inte sprids till det apatiska utrymmet. Otillräcklig såddtäthet (dvs. < 2.5×105 celler/cm2) kan leda till oförmåga att bilda en korrekt barriär, vilket indikeras av diffusion av medium från det basolaterala till det apatiska utrymmet, vilket resulterar i nedsänkta istället för ALI-odlingsförhållanden62. Serumfritt keratinocyttillväxtmedium (se Tabell över material) föredrogs för reproducerbarhetsändamål, eftersom det erbjuder fördelen att arbeta med ett kemiskt definierat medium och minskar risken för kontaminering. Detta medium har en lägre kalciumkoncentration (dvs. 60 μM) och stimulerar därför spridningen av keratinocyter87. Att öka kalciumkoncentrationen (dvs. 1,5 mM) från rhe-odlingens första steg gynnar keratinocyt differentiering och hudbarriärbildning och homeostas49. Dessutom kompletteras ALI-mediet med askorbinsyra, vilket har visat sig vara avgörande för bildandet av SC-lipider och för att främja differentiering52,53,54. ALI-mediet innehåller också KGF, som är en tillväxtfaktor som utsöndras av fibroblaster som kan binda till keratinocyttransmembranreceptorer och vid aktivering har en dubbel roll i differentiering och sårreparation55,88. Det är viktigt att uppdatera ALI-mediet med specifika tidsintervall för att ge en konstant tillförsel av färska näringsämnen till rhes. Användningen av ett bärplåtssystem är avgörande för RhE-odling i större skala (dvs. 24 skär/platta). Det erbjuder fördelen med att spara tid, minska risken för kontaminering och lämnar mindre utrymme för införandet av mänskliga fel. Det ger också möjlighet att odla rhes i en hög volym media (dvs. 1,5 ml), vilket minskar det önskade antalet ALI-medium-uppdateringar. Dessutom ger det möjlighet att överföra en full platta med skär till en tallrik med färskt medium, undvika kontakt med skären individuellt eller avslöja plåtlocket.
Det finns flera begränsningar i RhE-modellen som bör noteras. I inhemsk mänsklig hud finns en jämvikt mellan spridningen av keratinocyter i basalskiktet och lossningen av hornhinnor i SC (dvs. desquamation)89. In vitro sker dock inte desquamation. Därför förblir hornhinnorna fästa vid RhE och bildar en tjock SC som är mindre fysiologiskt relevant. Därför finns det en begränsad odlingstid av rhes. Dessutom är denna RhE-modell enkel och enkel, eftersom den består av en singular celltyp, det vill säga keratinocyten, som är den mest rikliga celltypen av epidermis. Det finns dock andra celltyper bosatta i epidermis, såsom melanocyter, dendritiska celler (dvs. Langerhansceller), T-celler (t.ex. CD8+ celler) och Merkel-celler13. För att öka hudmodellens fysiologiska relevans har forskare gjort hudmodeller mer komplexa genom att tillsätta melanocyter38 , immunceller39, eller patientbaserade celler90. Man bör komma ihåg att barriäregenskaperna hos mänskliga hudmodeller är olika jämfört med inhemsk mänsklig hud, på grund av särskilt en annan SC lipidkomposition och en högre barriärpermeabilitet 91,92,93,94,95. Flera studier har dock rapporterat förändringar i barriäregenskaper hos mänskliga hudmodeller genom odling under hypoxi96 eller minskad relativ luftfuktighet97, modulering av dermalmatrisen med chitosan98, och förändring av de fria fettsyrorna i odlingsmediet99. Dessutom, i både enkla och mer komplexa rhes, kan kulturförhållandena och medium sammansättning moduleras för att efterlikna patologiska egenskaper. Genom att utmana modellen med cytokiner, en onormal morfologi100 och förändringar i gen- och proteinuttrycksnivåer kan fastställas som vanligtvis observeras vid vanliga hudsjukdomar, såsom atopisk dermatit och psoriasis35,101,102,103,104,105. Att tysta specifika gener i keratinocyter innan 3D-modellens rekonstitutionsprocess påbörjas är ett annat tillvägagångssätt som används för att efterlikna funktioner i hudsjukdomar och undersöka nya terapeutiska lösningar106,107. Förutom modellering av ett epidermalt skikt kan ett dermala fack inkluderas i modellen (dvs. namngivna motsvarigheter till mänsklig hud eller modeller med full tjocklek) genom att bädda in fibroblaster i en kollagenmatris före RhE-beredning, vilket gör det mer fysiologiskt relevant och lämpligt för åldrande och sårläkningsrelaterade studier108,109,110. Dessutom har tumörsfäroider tillsatts humana hudekvivalenter för att studera melanomprogression111,112. De senaste framstegen inom hudmodeller är biotryck och skin-on-a-chip. Flera forskargrupper har nyligen lyckats utveckla (perfusable) biotryckta hudekvivalenter45,113,114. Det föreslagna protokollet utnyttjar ett 24-brunnsformat och en bärplåt, vilket undviker att skär hanteras individuellt. Studieskalan är dock fortfarande ganska begränsad och saknar automatisering. Genom att implementera användningen av biotryck eller hud-på-ett-chip kan mindre hudmodeller användas med mer automatiserade processer och i större skala.
RhE som beskrivs i detta protokoll har flera likheter med de redan utvecklade och väl karakteriserade kommersiella epidermala modellerna. Den morfologiska analysen har visat att även om antalet livskraftiga skikt i den föreslagna RhE-modellen är lägre jämfört med den inhemska mänskliga huden (dvs. 6-7 jämfört med 7-14), är den jämförbar med EpiDerm RhE-modellen (dvs. 8-12)70. På samma sätt som EpiDerm-, EpiSkin- och SkinEthic-modellerna visar det övre RhE-skiktet ett korgvävt mönster av tätt packade corneocytelager28. Dessutom visade TEM-analysen att antalet SC-skikt i den föreslagna RhE-modellen (dvs. 15–25) är jämförbart med Antalet skikt i EpiDerm (dvs. 16–25)70. Sammantaget visar den föreslagna RhE-modellen en liknande struktur som andra kommersialiserade epidermala modeller, som efterliknar den inhemska mänskliga epidermis. Vävnadsintegriteten mätt med TEER ligger inom räckhåll för kommersiella RhE-modeller (dvs. mellan 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 och andra interna rhes (dvs. cirka 5000 Ω,cm2)74,115. Den föreslagna RhE-modellen visar sig vara väl differentierad, vilket indikeras av närvaron och korrekt lokalisering av differentiering och vävnad vidhäftning markörer. Dessutom visar sig den föreslagna RhE-modellen vara lyhörd för proinflammatoriska stimuli (dvs. LPS och TNF-α).
Avslutningsvis visar det nuvarande protokollet hur man producerar rhes på ett tillförlitligt sätt och i relativt stor skala för att tillgodose forskarnas behov i både akademiska och privata institutioner. Den föreslagna RhE-modellen visar sig ha liknande morfologi, epidermal differentiering och biologisk lyhördhet för andra befintliga kommersiella modeller. Det ger ett alternativt verktyg för både det farmaceutiska och dermato-kosmetiska området när tillgång till en relevant hudmodell krävs.
The authors have nothing to disclose.
Europeiska unionens program för forskning och innovation vid Horisonten 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidraget med bidragsavtalet nr 765602 finansierade detta arbete. Alla författare erkänner stödet från Adolphe Merkle Foundation och Universitetet i Ferrara och erkänner tacksamt Dow Silicones Belgium. Dr. Miguel Spuch-Calvar är erkänd för att förbereda de grafiska bilderna av RhE-odlingsprocessen. Författarna tackar Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati och Dr. Agnès Tessier för deras tekniska stöd och diskussioner.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |