Использование компьютерного анализа изображений для улучшения количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1

Summary

Мы описываем более последовательный и оперативный метод количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1 с помощью Фиджи-ImageJ.

Abstract

Рак молочной железы является разрушительным злокачественным новообразованием, на долю которого приходится 40 000 случаев смерти женщин и 30% новых диагнозов рака у женщин только в Соединенных Штатах в 2019 году. Основной причиной смерти от рака молочной железы является метастатическое бремя. Поэтому доклинические модели рака молочной железы должны анализировать метастатическое бремя, чтобы быть клинически актуальными. Модель рака молочной железы 4T1 обеспечивает спонтанно метастазирующую, поддающуюся количественной оценке модель мыши для iv стадии рака молочной железы человека. Тем не менее, большинство протоколов 4T1 количественно метастатического бремени, вручную подсчитывая окрашенных колоний на пластинах культуры тканей. Хотя этого достаточно для тканей с более низким метастатическим бременем, человеческая ошибка в ручном подсчете приводит к несовместимым и переменным результатам, когда пластины стечены и трудно подсчитать. Этот метод предлагает компьютерное решение ошибки подсчета людей. Здесь мы оцениваем протокол с использованием легких, высоко метастатической ткани в модели 4T1. Изображения метиленовых голубо-окрашенных пластин приобретаются и загружаются для анализа на Фиджи-ImageJ. Затем Fiji-ImageJ определяет процент выбранной области изображения синего цвета, что представляет собой процент пластины с метастатическим бременем. Этот компьютерный подход дает более последовательные и оперативные результаты, чем ручной подсчет или гистопатологическая оценка высокомастатической ткани. Последовательность результатов Fiji-ImageJ зависит от качества изображения. Небольшие различия в результатах между изображениями могут произойти, поэтому рекомендуется сделать несколько изображений и усредить результаты. Несмотря на свои минимальные ограничения, этот метод является улучшением количественной метастатической нагрузки в легких, предлагая последовательные и быстрые результаты.

Introduction

Одна из восьми женщин будет диагностирован рак молочной железы в ее жизни, и все же, несмотря на несколько вариантов лечения рака молочной железы является второй ведущей причиной рака, связанных смертей у^{американских женщин 1}. Эти женщины не умирают от первичной опухоли в груди. Вместо этого, метастатическое бремя несет ответственность за смертность от этого заболевания, как это обычно распространяется на легкие, кости, мозг, печень и лимфатические^{узлы 2}. Из-за этого, модели рака молочной железы должны оценить метастазы, чтобы способствовать сдерживанию смертности от этого заболевания. Модель рака молочной железы 4T1 murine является превосходным протоколом для достижения этой цели. Метод, описанный здесь предлагает улучшение модели 4T1 с помощью Фиджи-ImageJ для количественной оценки метастазов легких, производя последовательные и оперативные результаты.

Модель 4T1 хорошо зарекомендовала себя, большинство лабораторий используют протоколы, такие как описаны Пуласки и Остранд-Розенберг в 2001^{году 3}. Линия клеток 4T1 6-Thioguanine (6TG) устойчива и представитель iv стадии, тройной отрицательный^{рак молочной железы 3,4,5}. Это клинически актуально, так как это ортопедическая модель и спонтанно метастазирует в те же органы, что и при раке молочной^{железы человека 3,4.} Клетки 4T1 спонтанно метастазируют с предсказуемой скоростью, основанной на количестве клеток, введенных^3,4. Важно отметить, что генетические различия между мышами, используемыми здесь, вызвали ожидаемую меж индивидуальную изменчивость метастатического бремени. Для оценки метастазов, ткани собирают для сбора и количественной оценки раковых клеток в отдаленных местах с использованием 6TG отбора и метиленового синего окрашивания. Результатом является коллекция пластин культуры тканей с синими точками, представляющими метастатические колонии. Однако протокол Пуласки и Остранд-Розенберга количественно определяет метастатические колонии, вручную подсчитывая их, и поэтому это было стандартным средством оценки метастазов в этой модели. Хотя это легко для тканей с низким метастатическим бременем, ткани, как легкие часто нагруженные метастазами. Поскольку легочные пластины могут быть сильно стеченными, точно и точно количественными метастатическими колониями путем ручного подсчета трудно и склонны к человеческой ошибке. Чтобы лучше определить метастатическое бремя, мы описываем использование Fiji-ImageJ для компьютерного решения ошибки подсчета людей. Гистопатологический анализ с гематоксилином и эозином (H и E) окрашивание является еще одним средством количественной оценки метастазов легких, и интересно также была улучшена с Фиджи-ImageJ программное^{обеспечение 6,7}. Однако, поскольку гистопатологический анализ наблюдает один кусочек легких, он может быть неточным и непредставительным. Это потому, что модель 4T1 вызывает несколько метастатических поражений по всему органу, которые не равномерно распределены. В то время как общие тенденции между гистопатологическим анализом и ручным^{подсчетом могут быть похожи на 8, индивидуальные}значения могут отличаться, и поэтому гистопатологический анализ не должен использоваться в качестве единственного средства количественной оценки. Мы демонстрируем преимущества по сравнению с гистопатологическим анализом и несоответствиями в ручном подсчете между различными счетчиками, а также демонстрируем последовательность использования Фиджи-ImageJ. Кроме того, мы показываем, что этот метод может сократить время инкубации с 10-14 дней до 5 дней, то есть исследователи могут анализировать данные из своего исследования гораздо раньше, чем при полагаться на ручной подсчет.

Этот метод представляет собой набор простых корректировок к протоколу Пуласки и Остранд-Розенберга^3. Поскольку модель 4T1 широко используется, и потому, что метастазы легких является критическим параметром для измерения в доклинических моделях, мы считаем, что этот метод может быть широко использован и очень ценен для исследователей рака молочной железы. Единственными дополнительными принадлежностями, необходимыми являются камера и доступ к компьютеру с Фиджи-ImageJ, свободное программное обеспечение, часто используемое в анализе^{изображений 9}. Этот метод специально фокусируется на метастазах легких, но он может быть использован для других тканей со значительным метастатическим бременем.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Технологического института Вирджинии и в соответствии с Национальным руководством по охране здоровья и использованию лабораторных животных. Выполнение этого протокола т…

Representative Results

Этот метод содержит простые корректировки протокола3 Pulaski и Ostrand-Rosenberg 4T1 и может быть визуализирован на рисунке 1. Когда 3 отдельных исследователя вручную подсчитали метастатические колонии для 12 легочных пластин (1:10 разбавления), результаты были очень несов…

Discussion

Как попродемонстрировано, ручной подсчет метастатических колоний на каждой пластине легких может быть неточным и неточным методом количественной оценки метастазов легких, демонстрируя необходимость лучшего средства количественной оценки(рисунок 2). Гистопатологиче?…

Materials

Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
1 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water