تجزئة نمو الخلايا البطانية في لوحات 6-Well على شاكر المداري للدراسات الميكانيكية الحيوية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة طلاء لتقييد نمو الخلايا البطانية إلى منطقة محددة من لوحة من 6 آبار لتطبيق إجهاد القص باستخدام نموذج شاكر المداري.
Abstract
الإجهاد القص المفروضة على جدار الشرايين من تدفق الدم يؤثر على مورفولوجيا الخلايا البطانية ووظيفة. وقد افترض تدني الحجم والتذبذب وضغوط القص متعددة الاتجاهات لتحفيز النمط الظاهري المؤيد للشرايين في الخلايا البطانية، في حين يعتقد أن الحجم الكبير والقص أحادي الاتجاه أو أحادي المحور يعززان التوازن المنزلي البطاني. تتطلب هذه الفرضيات المزيد من التحقيق ، ولكن التقنيات التقليدية في المختبر لها قيود ، وهي سيئة بشكل خاص في فرض ضغوط القص متعددة الاتجاهات على الخلايا.
وتتمثل إحدى الطرق التي تكتسب استخداما متزايدا في استزراع الخلايا البطانية في لوحات قياسية متعددة الآبار على منصة شاكر مداري؛ في هذه الطريقة البسيطة والمنخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية والمزمنة ، تنتج الوسيطة الدوارة أنماطا مختلفة وحجم القص ، بما في ذلك القص متعدد الاتجاهات ، في أجزاء مختلفة من البئر. ومع ذلك ، فإن لها قيدا كبيرا: فالخلايا في منطقة واحدة ، المعرضة لنوع واحد من التدفق ، قد تطلق وسطاء في الوسط تؤثر على الخلايا في أجزاء أخرى من البئر ، معرضة لتدفقات مختلفة ، وبالتالي تشوه العلاقة الظاهرة بين التدفق والنمط الظاهري.
هنا نقدم تعديلا سهلا وبأسعار معقولة للطريقة التي تسمح للخلايا أن تتعرض فقط لخصائص إجهاد القص المحددة. يقتصر بذر الخلايا على منطقة محددة من البئر عن طريق طلاء المنطقة ذات الاهتمام مع فيبروكتين ، يليه التخميل باستخدام محلول التخميل. في وقت لاحق ، يمكن تدوير اللوحات على شاكر ، مما يؤدي إلى تعرض الخلايا لمحات القص محددة جيدا مثل القص متعدد الاتجاهات منخفضة الحجم أو القص أحادي الاتجاه عالية الحجم ، اعتمادا على موقعها. كما كان الحال من قبل ، فإن استخدام أدوات بلاستيكية قياسية لثقافة الخلايا يسمح بإجراء مزيد من التحليل المباشر للخلايا. وقد سمح التعديل بالفعل بعرض الوسطاء القابلين للذوبان ، الذين تم إطلاقهم من الهيليوم تحت خصائص إجهاد القص المحددة ، التي تؤثر على الخلايا الموجودة في مكان آخر في البئر.
Introduction
استجابات خلايا الأوعية الدموية لبيئتهم الميكانيكية مهمة في الوظيفة الطبيعية للأوعية الدموية وفي تطور المرض1. كان علم الأحياء الميكانيكية للخلايا البطانية (ECs) التي تبطن السطح الداخلي لجميع الأوعية الدموية محورا خاصا للأبحاث الميكانيكية لأن ECs تعاني مباشرة من إجهاد القص الناتج عن تدفق الدم فوقها. مختلف التغيرات phenotypic مثل الاستجابات الالتهابية، وتغير صلابة ومورفولوجيا، والإفراج عن المواد النشطة vasoactive، وتوطين والتعبير عن البروتينات التقاطعية تعتمد على التعرض EC لإجهاد القص2،3،4. قد خصائص البطانية التي تعتمد على القص أيضا حساب لتطور غير مكتمل من الأمراض مثل تصلب الشرايين5،6،7.
ومن المفيد دراسة تأثير القص على المركبات الهيدروفلورية في الثقافة، حيث يمكن السيطرة على الضغوط، ويمكن عزل المركبات الهيدروفلورية عن أنواع الخلايا الأخرى. تستخدم عادة في الأجهزة المختبرية لتطبيق الإجهاد القص إلى ECs تشمل غرفة تدفق لوحة موازية ومخروط ولوحة viscometer، ولكن فقط أحادية النبض ثابت، والتذبذب، وتدفق pulsatile يمكن تطبيقها8،9. على الرغم من أن غرف التدفق المعدلة مع هندسات مدببة أو متفرعة ورقائق microfluidic التي تحاكي الهندسة الأنماطية قد تم تطويرها ، إلا أن إنتاجها المنخفض ومدة الثقافة القصيرة نسبيا التي من الممكن أن تشكل تحديا10، 11.
وتكتسب طريقة شاكر المداري (أو البئر الدوار) لدراسة التنظير البطاني، الذي تزرع فيه الخلايا في أدوات بلاستيكية قياسية لثقافة الخلايا توضع على منصة شاكر مداري، اهتماما متزايدا لأنها قادرة على فرض أنماط إجهاد معقدةمتغيرة مكانيا على المركبات الإلكترونية ذات الإنتاجية العالية (انظر الاستعراض الذي أجراه Warboys وآخرون. وقد استخدمت محاكاة ديناميات السوائل الحاسوبية (CFD) لتوصيف الاختلاف المكاني والزمني لإجهاد القص في بئر دوارة. الحركة الدوامية للوسط الثقافي الناجم عن الحركة المدارية لمنصة شاكر التي يتم وضع اللوحة عليها تؤدي إلى تدفق متعدد الاتجاهات منخفض الحجم (LMMF ، أو تدفق مفترض مؤيد للذرية) في المركز وتدفق أحادي المحور عالي الحجم (HMUF ، أو تدفق غير مركزي مفترض) على حافة آبار لوحة من 6 آبار. على سبيل المثال، ضغط القص الجداري متوسط الوقت (TAWSS) هو حوالي 0.3 باسكال في المركز و 0.7 باسكال على حافة لوحة 6-جيدا تدور في 150 دورة في الدقيقة مع دائرة نصف قطرها 5 ملم المداري13. تتطلب هذه الطريقة فقط الأواني البلاستيكية المتاحة تجاريا وشاكر المداري نفسه.
ومع ذلك ، هناك عيب في الطريقة (وإلى طرق أخرى لفرض التدفقات في المختبر): تطلق ECs الوسطاء القابلين للذوبان والجسيمات الدقيقة بطريقة تعتمد على القص14و15و16 وهذا السرومي قد يؤثر على ECs في مناطق البئر الأخرى غير تلك التي تم إطلاقها فيها ، بسبب الاختلاط في الوسط الدوار. قد يخفي هذا الآثار الفعلية للإجهاد القص على النمط الظاهري EC. على سبيل المثال، تكهن غيم وآخرون بأن هذا يفسر التأثير المطابق على ما يبدو لملامح القص المختلفة على النقل عبر الخلايا للجسيمات الكبيرة17.
هنا نحن نصف طريقة لتعزيز الالتصاق الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVEC) في مناطق محددة من لوحة 6-جيدا باستخدام طلاء فيبروكتين أثناء استخدام Pluronic F-127 لتمرير السطح ومنع النمو في أماكن أخرى. الأسلوب يحل القيد المذكور أعلاه لأنه ، عن طريق تقسيم نمو الخلايا ، ECs تجربة نوع واحد فقط من ملف القص ، ولا تتأثر الإفرازات من ECs تتعرض لمحات أخرى في مكان آخر في البئر.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة الدوامة جيدا قادرة على توليد ملامح تدفق معقدة في بئر واحد – انخفاض حجم التدفق متعدد الاتجاهات (LMMF) في المركز وتدفق أحادي المحور عالية الحجم (HMUF) على حافة البئر. ومع ذلك ، سيتم خلط إفرازات القص بوساطة الإجهاد من الوسيط القابل للذوبان في الوسط الدوامي وتؤثر على الخلايا في البئر بأكمله ، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بامتنان بمنحة مشروع مؤسسة القلب البريطانية (إلى PDW) ، والمجلس الوطني للبحوث الطبية في سنغافورة TAAP وDALM Grant (إلى XW ، NMRC / OFLCG /004/2018 ، NMRC / OFLCG / 001/2017) ، ومنحة A * STAR للدراسات العليا (إلى KTP) ، ومركز مؤسسة القلب البريطانية للتميز البحثي (إلى MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
