Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Summary

Aqui apresentamos um método de limpeza de tecido hidrofóbico que permite a visualização de moléculas-alvo como parte de estruturas cerebrais intactas. Esta técnica foi validada para o controle F344/N e ratos transgênicos HIV-1 de ambos os sexos.

Abstract

Os métodos de limpeza de tecidos hidrofóbicos são procedimentos facilmente ajustáveis, rápidos e de baixo custo que permitem o estudo de uma molécula de interesse em amostras de tecidos não endalterados. Os procedimentos tradicionais de imunolabelação requerem o corte da amostra em seções finas, o que restringe a capacidade de rotular e examinar estruturas intactas. No entanto, se o tecido cerebral pode permanecer intacto durante o processamento, estruturas e circuitos podem permanecer intactos para a análise. Métodos de limpeza previamente estabelecidos levam tempo significativo para limpar completamente o tecido, e os produtos químicos severos podem muitas vezes danificar anticorpos sensíveis. O método iDISCO limpa rapidamente e completamente o tecido, é compatível com muitos anticorpos e não requer nenhum equipamento de laboratório especial. Esta técnica foi inicialmente validada para o uso em tecido de camundongos, mas o protocolo atual adapta esse método a hemisférios de imagem de control e cérebros de ratos transgênicos. Além disso, o presente protocolo também faz vários ajustes no protocolo pré-existente para fornecer imagens mais claras com menor coloração de fundo. Os anticorpos para Iba-1 e hidroxilase de tyrosina foram validados no rato transgênico HIV-1 e em ratos de controle F344/N usando o presente método de limpeza de tecido hidrofóbico. O cérebro é uma rede entrelaçada, onde as estruturas trabalham juntas mais frequentemente do que separadamente umas das outras. Analisar o cérebro como um todo o sistema em oposição a uma combinação de peças individuais é o maior benefício de todo esse método de limpeza cerebral.

Introduction

Várias técnicas de limpeza tecidual foram validadas para uso no cérebro: hidrogel, hidrofílico e hidrofóbico. Essas técnicas visam tornar um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação através da administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índice de refração do meio de imagem escolhido, uma imagem clara da amostra pode ser obtida. Técnicas baseadas em hidrogel, como clarity, protegem biomoléculas no tecido ligando-as a hidrogéis à base de acríl, o que evita danos estruturais e perda de proteínas¹. No entanto, as técnicas de hidrogel utilizam produtos químicos severos do que têm o potencial de danificar tecidos mais frágeis, e amostras de tecido mais densas podem não ser compatíveis com o protocolo de hidrogel. Certas técnicas de hidrogel podem exigir equipamentos caros ou levar à expansão do tecido. Técnicas hidrofílicas, como o CUBIC, preservam a estrutura 3D através da formação de ligações de hidrogênio dentro do tecido². A expansão tecidual também pode ocorrer em certo protocolo hidrofílico. A capacidade de compensação das técnicas hidrofílicas muitas vezes não corresponde à capacidade que as técnicas hidrofóbicas têm, o que é importante para tecidos mais densos e grossos³.

Técnicas hidrofóbicas geralmente são rápidas, não requerem equipamentos especiais e produzem uma amostra fácil de manusear e armazenar. IDISCO é uma técnica hidrofóbica que elimina o encolhimento que pode ocorrer em outro protocolo hidrofóbico. Originalmente, a técnica de limpeza de tecidos iDISCO foi descrita por Renier et al.⁴ para os embriões e órgãos adultos densos de camundongos. Esta técnica remove a água do tecido na etapa inicial de desidratação, reduzindo assim a dispersão da luz. O tecido é permeabilizado durante o pré-tratamento para permitir a penetração profunda de anticorpos. Os corantes de fluor alexa no espectro vermelho distante são usados para imunolabeling para evitar a autofluorescência do tecido em comprimentos de onda mais baixos⁵. Tecidos que passaram por protocolos de limpeza hidrofóbica são capazes de ser manuseados facilmente e podem ser imagens várias vezes devido à longevidade dos corantes Alexa Fluor. Se armazenados corretamente, os tecidos podem fornecer imagens por meses a um ano após o processamento inicial.

No presente protocolo, anticorpos tyrosine hydroxylase (TH), anticorpo Iba1 e Subunit B (CTB) de tricô de toxina de cólera e cólera foram usados em cérebros de ratos machos e femininos e transgênicos HIV-1 (Tg). O rato HIV-1 Tg possui sete dos nove genes que compõem o genoma viral hiv-1, o que leva a um modelo não infeccioso de exposição proteica hiv-1 a longo prazo^6,7,8. Alterações dopaminérgicas já foram demonstradas anteriormente no rato HIV-1 Tg, e o próprio HIV-1 é uma doença inflamatória, por isso a escolha do anticorpo foi relevante para o desenho experimental^9,10,11,12. CTB é um rastreador que se liga aos neurônios via ligação ganglioside e pode ser usado para traçar projeções diferentes no cérebro. A CTB tem sido usada anteriormente para estudar projeções do núcleo accumbens até a área de nigra substantia, duas áreas do cérebro fortemente envolvidas com as vias dopaminérgicas^13,14,15.

Neste protocolo, o TH servirá como um marcador para a produção de dopamina, e o Iba1 marcará microglia ativada. O anticorpo TH usado rotula seletivamente uma única banda a aproximadamente 62 kDa que corresponde à hidroxilase de tirasina. O anticorpo Iba1 corresponde à sequência iba1 carboxy-terminal. Ambos os anticorpos foram criados em coelho e eram policlonais. CtB será usado para rastreamento retrógrado de neurônios da área de accumbens do núcleo até a área de nigra substantia. O protocolo atual também oferece uma diretriz para o ajuste do protocolo original iDISCO de duas maneiras distintas: 1) redução geral da coloração de fundo alterando os reagentes de soro nas etapas de bloqueio, e 2) dimensionamento do tempo de incubação para ser adequado para amostras de tecido maiores. No geral, o presente protocolo fornece evidências contínuas de que as técnicas de compensação hidrofóbica são viáveis nos tecidos cerebrais do rato, não têm interações prejudiciais perceptíveis com proteínas virais hiv-1 e são compatíveis com anticorpo TH, anticorpo Iba1 e CTB.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul. 1. Preparação da solução de estoque Solução 1 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado adicione 100 mL de salina tamponada de fosfato de 10x (PBS) e 2 mL de Triton X-100. Solução 2 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado, adicione 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 e 1 mL de solução de estoque heparin de 10 mg/mL….

Representative Results

A limpeza completa de grandes seções do tecido cerebral de rato F344/N e HIV-1 foi alcançada usando este protocolo de limpeza de tecido hidrofóbico modificado. A Figura 1 exibe uma imagem confocal típica para TH na região de nigra substantia. A Figura 1A representa uma mancha densa e positiva. Áreas densas como essas podem ser analisadas focando-se através do plano “Z” para confirmar a coloração positiva e a morfologia celular adequada. <strong class="…

Discussion

A limpeza de tecidos oferece uma solução para as limitações do protocolo IHC tradicional. Uma amostra transparente minimiza a dispersão e absorção da luz, que fornece acesso óptico de nível celular a tecidos intactos^18,19. As técnicas de limpeza de tecidos tornam um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação com a administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índi…

Materials

Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500