En enkel dry sectioning metod för att erhålla Hela-Frö-Sized Harts avsnitt och dess tillämpningar
Summary
Denna teknik möjliggör snabb och enkel beredning av hela frö-storlek harts avsnitt för observation och analys av celler, stärkelse granulat, och protein organ i olika regioner av utsädet.
Abstract
Cellernas, stärkelsegranulatets och proteinkroppars morfologi, storlek och mängd i utsäde bestämmer utsädets vikt och kvalitet. De är betydligt olika mellan olika regioner av utsäde. För att visa morfologier av celler, stärkelse granulat och protein organ tydligt, och kvantitativt analysera deras morfologi parametrar exakt, hela frö-storlek avsnitt behövs. Även om hela frö-storlek paraffin avsnitt kan undersöka ansamling av lagringsmaterial i frön, är det mycket svårt att kvantitativt analysera morfologi parametrar för celler och lagringsmaterial på grund av den låga upplösningen av den tjocka delen. Den tunna harts avsnittet har hög upplösning, men rutin harts sectioning metod är inte lämplig att förbereda hela-frö-storlek avsnitt av mogna frön med en stor volym och hög stärkelse innehåll. I denna studie presenterar vi en enkel torr snittning metod för att förbereda hela frö-storlek harts avsnitt. Tekniken kan förbereda korset och längsgående hela frö-stora delar av utveckling, mogna, grodda, och kokta frön inbäddade i LR Vit harts, även för stora frön med hög stärkelsehalt. Hela frö-storlek avsnitt kan färgas med fluorescerande ljusare 28, jod, och Coomassie lysande blå R250 att specifikt uppvisa morfologi av celler, stärkelse granulat, och protein organ tydligt, respektive. Den erhållna bilden kan också analyseras kvantitativt för att visa morfologi parametrar för celler, stärkelse granulat och protein organ i olika regioner av utsäde.
Introduction
Växtfrön innehåller lagringsmaterial som stärkelse och protein och ger energi och näring för människor. Formen, storleken och kvantiteten av cell- och lagringsmaterial bestämmer utsädets vikt och kvalitet. Cellerna och lagringsmaterial i olika regioner av utsäde har betydligt olika morfologier, särskilt för vissa hög-amylose spannmålsgrödor med hämning av stärkelse förgrening enzym IIb1,2,3. Därför är det mycket viktigt att undersöka morfologier av celler och lagringsmaterial i olika regioner av utsäde.
Paraffin snittning är en bra metod för att förbereda hela-frö-storlek avsnitt och kan uppvisa vävnad struktur av utsäde och ackumulering av lagringsmaterial i olika regioner av utsäde4,5,6. Paraffinsektionerna har dock vanligen 6-8 μm tjocklek med låg upplösning; således är det mycket svårt att tydligt observera och kvantitativt analysera cell- och lagringsmaterialens morfologi. Hartssektionerna har vanligen 1-2 μm tjocklek och hög upplösning och är mycket lämpliga att observera och analysera morfologin hos cell- och lagringsmaterial7. Den rutinmässiga harts snittningsmetoden har dock svårt att förbereda hela frö-storlek avsnitt, särskilt för frön med en stor volym och hög stärkelse innehåll; således finns det inget sätt att observera och analysera morfologi av celler och lagringsmaterial i olika regioner av utsädet. LR Vit harts är en akrylharts och uppvisar låg viskositet och stark permeabilitet, vilket leder till dess goda tillämpningar i förberedelserna av harts delen av frön, särskilt för spannmål mogna kärnor med stor volym och hög stärkelse innehåll. Dessutom kan provet inbäddat i LR Vit harts färgas lätt med många kemiska färgämnen för att tydligt uppvisa morfologi av celler och lagringsmaterial under ljus eller fluorescerande mikroskop7. I vårt tidigare papper har vi rapporterat en torr snittning metod för att förbereda hela-frö-storlek avsnitt av mogna spannmålskärnor inbäddade i LR Vit harts. Metoden kan också förbereda hela frö-storlek avsnitt av utveckling, grodda och kokta spannmål kärna8. Den erhållna helfröstora sektionen har många tillämpningar inom mikromorfologi observation och analys, särskilt för tydligt visning och kvantitativt analysera morfologi skillnader cell och lagringsmaterial i olika regioner av utsäde8,9.
Denna teknik är lämplig för forskare som vill observera mikrostrukturen av vävnad och formen och storleken på celler, stärkelse granulat, och protein organ i olika regioner av utsäde med hjälp av ljusmikroskop. Bilderna av helfröstora sektioner färgas speciellt för uppvisar celler, stärkelse granulat och protein organ kan analyseras av morfologi analys programvara för att kvantitativt mäta morfologi parametrar av celler, stärkelse granulat och protein organ i olika regioner av utsäde. För att visa den tekniska tillämpligheten och hela fröstora sektionsapplikationer har vi undersökt de mogna fröna från majs och raps och utvecklande, grodda och kokta kärnor av ris i denna studie. Protokollet innehåller fyra processer. Här använder vi mogen majskärna, som är den svåraste i att förbereda helfröstora sektioner på grund av den stora volymen och hög stärkelsehalt, som ett prov för att ställa ut processerna steg för steg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fröna är den viktigaste förnybara resursen för livsmedel, foder och industriell råvara, och är rika på lagringsmaterial som stärkelse och protein. Cellernas morfologi och kvantitet samt lagringsmaterialens innehåll och konfigurering påverkar vikten och kvaliteten påfröna 7,12. Även om stereologi och bildanalys teknik kan mäta storlek och mängd av celler i en vävnad region, de saknas i många laboratorier. Den paraffin och harts avsnitt ger en två…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering tillhandahölls av National Natural Science Foundation of China (32071927), Talent Project of Yangzhou University och den prioriterade akademiska programutvecklingen av Jiangsu högre utbildningsinstitutioner.
Materials
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
