En simpel tør sektionsmetode for opnåelse af fuldse-frø-størrelse harpiks sektion og dens anvendelser
Summary
Denne teknik giver mulighed for hurtig og enkel forberedelse af hele frø-størrelse harpiks sektion til observation og analyse af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frøet.
Abstract
Morfologien, størrelsen og mængden af celler, stivelsesgranulat og proteinstoffer i frø bestemmer frøets vægt og kvalitet. De er væsentligt forskellige blandt forskellige områder af frø. For at se morfologier af celler, stivelse granulat og protein organer klart, og kvantitativt analysere deres morfologi parametre præcist, hele frø-størrelse sektion er nødvendig. Selv om hele frø-størrelse paraffin sektion kan undersøge ophobning af lagermaterialer i frø, er det meget vanskeligt at kvantitativt analysere morfologi parametre for celler og opbevaringsmaterialer på grund af den lave opløsning af den tykke sektion. Den tynde harpiks sektion har høj opløsning, men den rutinemæssige harpiks sektionsmetode er ikke egnet til at forberede hele frø-størrelse del af modne frø med en stor volumen og høj stivelse indhold. I denne undersøgelse præsenterer vi en simpel tør sektionsmetode til forberedelse af hele frøstørrelse harpiks sektion. Teknikken kan forberede tværs og langsgående fuldkornsstørrelse dele af udvikle, modne, spirede, og kogte frø indlejret i LR Hvid harpiks, selv for store frø med højt stivelsesindhold. Hele frø-størrelse sektion kan farves med fluorescerende lysere 28, jod, og Coomassie strålende blå R250 til specifikt at udstille morfologi af celler, stivelse granulat, og protein organer klart, henholdsvis. Billedet opnået kan også analyseres kvantitativt for at vise morfologi parametre af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frø.
Introduction
Plantefrø indeholder lagringsmaterialer såsom stivelse og protein og giver energi og ernæring til mennesker. Formen, størrelsen og mængden af celle- og opbevaringsmaterialer bestemmer frøets vægt og kvalitet. Cellerne og lagermaterialerne i forskellige områder af frø har betydeligt forskellige morfologier, især for nogle høj-amylose kornafgrøder med hæmning af stivelse forgreningsenzymet IIb1,2,3. Derfor er det meget vigtigt at undersøge morfologier af celler og opbevaringsmaterialer i forskellige områder af frø.
Paraffinsektion er en god metode til at forberede hele frøstørrelsen og kan udvise frøs vævsstruktur og akkumulering af opbevaringsmateriale i forskellige områder af frø4,5,6. Paraffinsektionerne har dog normalt 6-8 μm tykkelse med lav opløsning; Det er derfor meget vanskeligt klart at observere og kvantitativt analysere morfologien af celle- og lagringsmaterialer. Harpikssektionerne har normalt 1-2 μm tykkelse og høj opløsning og er meget velegnede til at observere og analysere morfologien af celle- og opbevaringsmaterialer7. Den rutinemæssige harpikssektionsmetode har imidlertid svært ved at forberede hele frødelen, især for frø med et stort volumen og højt stivelsesindhold; Således er der ingen måde at observere og analysere morfologi af celler og opbevaringsmaterialer i forskellige regioner af frøet. LR Hvid harpiks er en akryl harpiks og udviser lav viskositet og stærk gennemtrængelighed, hvilket fører til dens gode anvendelser i udarbejdelsen af harpiks del af frø, især for korn modne kerner med stor volumen og højt stivelsesindhold. Desuden kan prøven indlejret i LR Hvid harpiks let farves med mange kemiske farvestoffer til klart at udstille morfologi af celler og opbevaringsmaterialer under lys eller fluorescerende mikroskop7. I vores tidligere papir, har vi rapporteret en tør sektionsmetode til forberedelse af hele frø-størrelse dele af modne korn kerner indlejret i LR Hvid harpiks. Metoden kan også forberede hele frø-størrelse del af udvikling, spirede og kogte korn kerne8. Den opnåede hele frø-størrelse sektion har mange anvendelser i mikromorfologi observation og analyse, især for klart at se og kvantitativt analysere morfologi forskelle i celle-og lagermaterialer i forskellige regioner af frø8,9.
Denne teknik er velegnet til forskere, der ønsker at observere mikrostruktur af væv og formen og størrelsen af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frø ved hjælp af lys mikroskop. Billederne af hel-frø-størrelse sektioner farves specielt til at udstille celler, stivelse granulat, og protein organer kan analyseres ved morfologi analyse software til kvantitativt at måle morfologi parametre af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige områder af frø. For at påvise den tekniske anvendelighed og afsnitsapplikationer af hele frøstørrelse har vi undersøgt de modne frø af majs og raps og risudviklede, spirede og kogte kerner af ris i denne undersøgelse. Protokollen indeholder fire processer. Her bruger vi moden majskerne, som er den vanskeligste til at forberede de store sektioner på størrelse med frø på grund af det store volumenindhold og det høje stivelsesindhold, som en prøve til at udstille processerne trin for trin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frøene er den vigtigste vedvarende ressource for fødevarer, foder og industrielle råvarer, og er rige på opbevaring materialer såsom stivelse og protein. Cellernes morfologi og kvantitet og opbevaringsmaterialernes indhold og konfiguration påvirker vægten og kvaliteten af frø7,12. Selvom stereologi og billedanalyseteknologi kan måle størrelsen og mængden af celler i en vævsregion, mangler de i mange laboratorier. Paraffin- og harpikssektionerne giver …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen blev ydet af National Natural Science Foundation of China (32071927), Talent Project of Yangzhou University og Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
