Tam Tohum Lu Reişin Elde Edilmesinde Basit Bir Kuru Kesit Yöntemi ve Uygulamaları
Summary
Bu teknik, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin gözlem ve analizi için tam tohum büyüklüğünde reçine bölümünün hızlı ve basit hazırlanmasına olanak sağlar.
Abstract
Tohumun morfolojisi, büyüklüğü ve miktarı, nişasta granülleri ve tohumdaki protein kütleleri tohumun ağırlığını ve kalitesini belirler. Onlar tohum farklı bölgeler arasında önemli ölçüde farklıdır. Hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfolojilerini net bir şekilde görebilmek ve morfoloji parametrelerini nicel olarak doğru analiz edebilmek için tohum büyüklüğünde ki tüm bölüme ihtiyaç vardır. Tohum büyüklüğündeki parafin bölümü tohumlardaki depolama malzemelerinin birikimini araştırabilse de, kalın bölümün düşük çözünürlüğü nedeniyle hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfoloji parametrelerini nicel olarak analiz etmek çok zordur. İnce rezorin bölümü yüksek çözünürlüğe sahiptir, ancak rutin rezorin kesit yöntemi büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ile olgun tohumların tam tohum büyüklüğünde bölümünü hazırlamak için uygun değildir. Bu çalışmada, tohum büyüklüğündeki reişin hazırlanması için basit bir kuru kesit yöntemi sayılmiyoruz. Bu teknik, lr beyaz reçine gömülü, olgun, çimlenmiş ve pişmiş tohumlar, yüksek nişasta içeriği ile büyük tohumlar için bile, çapraz ve uzunlamasına tam tohum ölçekli bölümleri hazırlayabilir. Tüm tohum büyüklüğündeki bölüm floresan parlatıcı 28, iyot ve Coomassie parlak mavi R250 ile özellikle hücrelerin morfolojisi sergilemek için, nişasta granülleri, ve protein organları açıkça, sırasıyla. Elde edilen görüntü, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfoloji parametrelerini göstermek için nicel olarak analiz edilebilir.
Introduction
Bitki tohumları nişasta ve protein gibi depolama malzemeleri içerir ve insanlar için enerji ve beslenme sağlar. Hücre ve depolama malzemelerinin şekli, boyutu ve miktarı tohumun ağırlığını ve kalitesini belirler. Tohum farklı bölgelerde hücreleri ve depolama malzemeleri önemli ölçüde farklı morfolojileri var, özellikle nişasta dallanma enzimIIbinhibisyonu ile bazı yüksek amylose tahıl bitkileriiçin,2,3. Bu nedenle, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojilerinin araştırılması çok önemlidir.
Parafin kesiti tüm tohum büyüklüğündeki bölümü hazırlamak için iyi bir yöntemdir ve tohumun dokuyapısını ve tohum4,5,6farklı bölgelerde depolama malzemesi birikimini sergileyebilir. Ancak, parafin kesitleri genellikle düşük çözünürlükte 6-8 μm kalınlığa sahiptir; bu nedenle hücre ve depolama malzemelerinin morfolojisini net bir şekilde gözlemlemek ve nicel olarak analiz etmek çok zordur. Rezorin kesitleri genellikle 1-2 μm kalınlığında ve yüksek çözünürlüğe sahiptir ve hücre ve depolama malzemelerinin morfolojisini gözlemlemek ve analiz etmek için çok uygundur7. Ancak, rutin rezorin kesit yöntemi, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ne olursa olsun tohumlar için tüm tohum büyüklüğündeki bölümü hazırlamakta güçlük çekmiştir; bu nedenle, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojisini gözlemlemenin ve analiz etmenin bir yolu yoktur. LR Beyaz reçin bir akrilik reçine ve düşük viskozite ve güçlü geçirgenlik sergiler, tohumların reçine bölümünü n hazırlanmasında iyi uygulamalara yol açan, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ile tahıl olgun çekirdekleri için. Buna ek olarak, LR Beyaz reçine gömülü örnek açıkça ışık veya floresan mikroskop altında hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojisi sergilemek için birçok kimyasal boyalar ile kolayca lekeli olabilir7. Bir önceki yazımızda, LR White reçine gömülü olgun tahıl çekirdeklerinin tohum büyüklüğündeki bölümlerini hazırlamak için kuru bir kesit yöntemi bildirmiştik. Yöntem aynı zamanda gelişmekte olan, çimlenmiş ve pişmiş tahıl çekirdeği8tam tohum büyüklüğünde bölüm hazırlayabilirsiniz. Elde edilen tam tohum büyüklüğündeki bölüm mikromorfoloji gözlem ve analizinde, özellikle tohum8,9’unfarklı bölgelerindeki hücre ve depolama malzemelerinin morfoloji farklılıklarının net bir şekilde görüntülenmesi ve nicel olarak analiz edilebilmiştir.
Bu teknik, ışığın mikroskobu kullanılarak tohumun farklı bölgelerindeki doku ların mikro yapısını ve hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin şekil ve büyüklüğünü gözlemlemek isteyen araştırmacılar için uygundur. Özellikle hücreler, nişasta granülleri ve protein cisimleri sergilemek için boyanmış tam tohum büyüklüğündeki bölümlerin görüntüleri, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfoloji parametrelerini nicel olarak ölçmek için morfoloji analiz yazılımı ile analiz edilebilir. Teknik uygulanabilirliği ve tam tohum büyüklüğündeki kesit uygulamalarını göstermek amacıyla, bu çalışmada mısır ve yağlı tohum tecavüzünün olgun tohumlarını ve gelişen, çimlenmiş ve pişmiş pirinç çekirdeklerini araştırdık. Protokol dört işlem içerir. Burada, büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği nedeniyle tohum büyüklüğündeki bölümlerin hazırlanmasında en zor olan olgun mısır çekirdeğini, süreçleri adım adım sergilemek için örnek olarak kullanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tohumlar gıda, yem ve endüstriyel hammadde için en önemli yenilenebilir kaynak, ve nişasta ve protein gibi depolama malzemeleri açısından zengindir. Hücrelerin morfolojisi ve miktarı ile depolama malzemelerinin içeriği ve konfigürasyonu tohumların ağırlığını ve kalitesini etkiler7,12. Stereoloji ve görüntü analizi teknolojisi bir doku bölgesindeki hücrelerin boyutunu ve miktarını ölçebilse de, pek çok laboratuvarda eksiktir. Parafin …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32071927), Yangzhou Üniversitesi Yetenek Projesi ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
