Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation
Summary
Ce protocole décrit la purification de la tubuline à partir de sources à petite ou moyenne échelle telles que les cellules de culture ou les cerveaux d’une seule souris, à l’aide de cycles de polymérisation et de dpolymérisation. La tubuline purifiée est enrichie en isotypes spécifiques ou a des modifications posttranslationnelles spécifiques et peut être utilisée dans des tests de reconstitution in vitro pour étudier la dynamique et les interactions des microtubules.
Abstract
Un aspect important des études du cytosquelette de microtubule est l’investigation du comportement de microtubule dans les expériences in vitro de reconstitution. Ils permettent l’analyse des propriétés intrinsèques des microtubules, telles que la dynamique, et de leurs interactions avec les protéines associées aux microtubules (MAP). Le « code de la tubuline » est un concept émergent qui indique différents isotypes de la tubuline et diverses modifications posttranslationnelles (MNP) en tant que régulateurs des propriétés et fonctions des microtubules. Pour explorer les mécanismes moléculaires du code de la tubuline, il est crucial d’effectuer des expériences de reconstitution in vitro à l’aide de tubuline purifiée avec des isotypes et des MNP spécifiques.
À ce jour, cela a été techniquement difficile que la tubuline du cerveau, qui est largement utilisé dans les expériences in vitro, abrite de nombreux M PT et a une composition définie isotype. Par conséquent, nous avons développé ce protocole pour purifier la tubuline à partir de différentes sources et avec différentes compositions d’isotypes et ptms contrôlés, en utilisant l’approche classique des cycles de polymérisation et de démlymerisation. Comparée aux méthodes existantes basées sur la purification d’affinité, cette approche produit la tubuline pure et polymérisation-compétente, car la tubuline résistante à la polymérisation ou à la dénolysation est jetée pendant les étapes successives de purification.
Nous décrivons la purification de la tubuline à partir de lignées cellulaires, cultivées soit en suspension, soit en cultures adhérentes, et à partir de cerveaux de souris simples. La méthode décrit d’abord la génération de masse cellulaire dans les paramètres de suspension et d’adhérent, l’étape de la lyse, suivie des étapes successives de purification de la tubuline par des cycles de polymérisation-dérimérisation. Notre méthode produit de la tubuline qui peut être utilisée dans des expériences traitant de l’impact du code de la tubuline sur les propriétés intrinsèques des microtubules et des interactions microtubules avec les protéines associées.
Introduction
Les microtubules jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus cellulaires. Ils donnent aux cellules leur forme, construisent des fuseaux méiotiques et mitotiques pour la ségrégation chromosomique, et servent de pistes pour le transport intracellulaire. Pour remplir ces diverses fonctions, les microtubules s’organisent de différentes manières. L’une des questions intrigantes sur le terrain est de comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent aux microtubules structurellement et évolutionnistes de s’adapter à cette pléthore d’organisations et de fonctions. Un mécanisme potentiel est la diversification des microtubules, qui est définie par le concept connu sous le nom de « code tubulin »1,2,3. Le code de la tubuline comprend deux composantes principales : l’incorporation différentielle de produits géniques α et β-tubulin (isotypes tubulaires) dans les microtubules et les modifications posttranslationnelles à la tubuline (MNP).
Depuis les années 1970, les expériences de reconstitution in vitro, combinées à l’évolution des techniques de microscopie légère, ont ouvert la voie à d’importantes découvertes sur les propriétés des microtubules : instabilitédynamique 4 et tapisroulant 5, et leurs autres mécanismeset fonctions 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Presque toutes les expériences in vitro réalisées jusqu’ici ont été basées sur la tubuline purifiée du tissu cérébral utilisant des cycles répétés de polymérisation et de dpolymérisation16,17. Bien que la purification du tissu cérébral confère l’avantage d’obtenir la tubuline de haute qualité en grandes quantités (généralement des quantités de gramme), un inconvénient important est l’hétérogénéité que la tubuline purifiée à partir du tissu cérébral est un mélange de différents isotypes de tubuline et est enrichi avec de nombreux PTMs tubulin. Cette hétérogénéité rend impossible la délimiture du rôle d’un PTM ou d’un isotype de tubuline particulier dans le contrôle des propriétés et des fonctions des microtubules. Ainsi, la production d’une tubuline compétente en assemblage avec des MNP tubulaires contrôlés et une composition homogène d’isotype est essentielle pour traiter les mécanismes moléculaires du code de la tubuline.
Récemment, une approche pour purifier la tubuline par chromatographie d’affinité utilisant le domaine de TOG microtubule-liant (gène tumeur-surexprimé) de levure Stu2p a étédéveloppée 18. Dans cette méthode, la tubuline dans les lysates bruts des cellules ou des tissus est passée à travers une colonne où elle se lie au domaine TOG immobilisé par matrice, ce qui permet l’analyse de l’ensemble du pool de tubulines d’un échantillon donné, voire très petit. Une approche attendue depuis longtemps pour purifier la tubuline recombinante a également été décrite ces dernières années. Il est basé sur le système de baculovirus, dans lequel un vecteur bi-cistronic contenant des gènes de α- et β-tubulin est exprimé dans les cellules d’insecte19. Cependant, cette méthode est très lourde et prend beaucoup de temps et est donc principalement utilisée pour étudier l’impact des mutations de la tubuline20 et des isotypes de la tubuline21,22,23 in vitro.
Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode qui utilise l’approche bien établie et largement utilisée de polymérisation-dépolymérisation comme modèle pour produire la tubuline avec différents niveaux de modification soit des lignes cellulaires ou du tissu cérébral de souris24. Dans cette procédure, la tubuline est pédalée entre la forme soluble (dimère tubuline à 4 °C) et polymère (microtubule à 30 °C en présence de guanosine 5′-triphosphate [GTP]). Chaque forme est séparée par des étapes successives de centrifugation : les dimers de tubuline resteront dans le supernatant après une rotation froide (4 °C), tandis que les microtubules seront granulés à 30 °C. En outre, une étape de polymérisation est effectuée à haute concentration de piperazine-N,N′-bis (acide 2-éthanesulfonique) (PIPES), ce qui permet l’élimination des protéines associées aux microtubules des microtubules et donc, de la tubuline finalement purifiée. La tubuline purifiée à partir des cellules HeLa S3 cultivées sous forme de cultures de suspension ou d’adhérent est pratiquement exempte de n’importe quelle tubuline PTM et a été utilisée dans des expériences récentes de reconstitution in vitro25,26,27,28. Nous avons en outre adapté la méthode pour purifier la tubuline à partir de cerveaux de souris simples, qui peuvent être utilisés pour un grand nombre de modèles de souris avec des changements dans les isotypes de la tubuline et les MNP.
Dans le protocole, nous décrivons d’abord la génération du matériau source (masse cellulaire ou tissu cérébral), sa lyse (figure 1A), suivie des étapes successives de polymérisation et de dénolysation des tubulines pour purifier la tubuline (Figure 1B). Nous décrivons en outre le processus d’évaluation de la pureté (figure 2A,B) et de la quantité (figure 3A,B) de la tubuline purifiée. La méthode peut être adaptée pour produire de la tubuline enrichie d’un PTM sélectionné en surexprimant une enzyme modérable dans les cellules avant la purification de la tubuline (Figure 4B). Alternativement, des enzymes modifiant la tubuline peuvent être ajoutées à la tubuline pendant le processus de purification. Enfin, nous pouvons purifier la tubuline dépourvue d’isotypes spécifiques ou de MNP provenant du cerveau de souris déficientes dans les enzymes correspondantes modificateurs de la tubuline (figure 4B)29.
La méthode que nous décrivons ici présente deux avantages principaux : (i) elle permet la production de quantités suffisamment importantes de tubuline en relativement peu de temps, et (ii) elle génère une tubuline pure de haute qualité, avec une composition spécifique d’isotype de tubuline ou des MNP. Dans la vidéo associée de ce manuscrit, nous soulignons quelques-unes des étapes critiques impliquées dans cette procédure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici fournit une plate-forme pour générer rapidement des tubulines de haute qualité et compétentes en assemblage en quantités moyennes-grandes à partir de lignées cellulaires et de cerveaux de souris simples. Il est basé sur le protocole d’étalon-or de purification de la tubuline à partir de cerveaux bovins utilisés sur le terraindepuis de nombreuses années 16,17. Un avantage particulier de l’approche est l’utilisation de cul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par l’ANR-10-IDEX-0001-02, le LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 et l’Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ est soutenu par l’Institut Curie, l’Agence nationale de la recherche du Français (ANR) décerne l’ANR-12-BSV2-0007 et l’ANR-17-CE13-0021, la subvention de l’Institut national du cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1, et la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) accorde à DEQ20170336756. MMM est soutenu par la Subvention Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p, et par la Subvention France Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. Jas a été soutenu par le programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 675737, et la subvention FDT201904008210. SB a été soutenu par la subvention frm FDT201805005465.
Nous remercions tous les membres du laboratoire Janke, en particulier J. Souphron, ainsi que G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) et A. Gautreau (Ecole Polytechnique) pour leur aide lors de l’établissement du protocole. Nous tenons à remercier l’établissement animalier de l’Institut Curie pour son aide à l’élevage et aux soins de la souris.
L’anticorps 12G10, développé par J. Frankel et M. Nelson, a été obtenu de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par l’Université de l’Iowa.
Materials
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
| 1.5- and 2-ml tubes | |||
| 14-ml round-bottom tubes | |||
| 15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
| 15-ml screw-cap tubes | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
| 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5-, 10- 20-ml syringes | |||
| 5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
| 50-ml screw-cap tubes | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
| Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
| Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
| Balance (0.1 – 10 g) | |||
| Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
| Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
| Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
| Cell culture hood | |||
| Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
| DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
| French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
| Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| Heating block | Stuart | #SBH130D | |
| Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
| L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
| Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
| Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
| Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Life Technologies | #14190169 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
| pH-meter | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
| PIPES | Sigma | #P6757 | |
| Pipette-boy | |||
| Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
| SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
| Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
| Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
| Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
| Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
| Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
| Vortex mixer | |||
| Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |
References
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
- Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
- Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
- Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
- Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
- Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
- Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
- Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
- Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
- Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
- Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
- Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
- Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
- Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
- Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
- Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
- Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
- Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
- Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
- Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
- Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
- Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).
