유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

Summary

우리는 이 신호 통로에 관련시킨 단백질 및 유전자 발현을 공부해서 TGF β 신호 및 TGF-β 유도한 EMT를 조사하기 위하여 체계적인 워크플로우를 기술합니다. 방법은 서양 블로팅, 루시파라제 기자 분석, qPCR 및 면역 불피스테인링을 포함한다.

Abstract

성장 인자 변환-β (TGF-β) 세포 간 통신에 중요 한 역할을 하는 분 비 다 기능 요인. TGF-β 신호의 동요는 유방암으로 이어질 수 있습니다. TGF-β 본질적인 세린/테로닌 키나아제 도메인을 포함하는 특정 세포 표면 TGF-β 타입 I 및 타입 II 수용체(즉, TβRI 및 TβRII)를 통해 증식 및 분화에 미치는 영향을 유도한다. TGF-β 유도이종 복합체 형성시, 활성화된 TβRI는 SMAD2 및 SMAD3인광에 의한 세포내 신호를 유도한다. 이러한 활성화된 SMADs는 플라스미노겐 활성화 억제제 1(PAI-1, SERPINE1 유전자에 의해 인코딩된 PAI-1)을 포함한 특정 표적 유전자를 조절하기 위해 SMAD4를 가진 이성모 복합체를 형성한다. 상피-중간엽 전이(EMT)의 유도는 1차 부위또는 먼 부위의 식민지화 과정에서 상피암세포를 허용하여 침략적인 표현형을 얻고 종양 진행을 유도한다. TGF-β EMT를 운전하여 유방암 침입의 강력한 유도자 역할을한다. 여기서, 우리는 선악성 인간 MCF10A-RAS (M2) 세포 및 마우스 NMuMG 상피 세포를 예로 사용하여 TGF β 신호 및 EMT 반응을 조사하는 체계적인 방법을 설명합니다. 당사는 루시프라아제 리포터 활성 및 SERPINE1 표적 유전자 발현을 이용한 서양 블로팅, SMAD3/SMAD4 의존적 전사 활성에 의한 TGF-β 유도된 SMAD2 인산화를 정하는 방법을 설명한다.qRT-PCR). 또한, 형태, 상피 및 중간엽 마커 발현, 필라멘트 액틴 염색 및 E-cadherin의 면역 형광 염색의 변화를 측정하여 TGF-β 유도 된 EMT를 검사하는 방법이 기재된다. 2개의 선택적 소분자 TGF-β 수용체 키나아제 억제제, GW788388 및 SB431542, TGF-β 유도SMAD2 인산화, 표적 유전자 및 EMT 마커 발현의 변화를 차단하기 위해 사용되었다. 더욱이, 우리는 중간엽 유방 Py2T 뮤린 상피 종양 세포의 전도를 선각세포로 기술합니다. 유방암에서 TGF-β 유도 된 신호 및 EMT를 검사하는 방법은 유방암에 대한 새로운 치료 접근법에 기여할 수 있습니다.

Introduction

세포카인 변환 성장 인자-β(TGF-β)은 TGF-β(즉, TGF-β1, -β2 및 -β3), 뼈 형태성 단백질(BmPs) 및 활성제^1,2를포함하는 구조적으로 및 기능적으로 관련된 폴리펩티드의 대규모 그룹의 프로토타입이다. 이러한 사이토카인은 모두 배아 발달과 조직 및 장기 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을^한다. TGF-β 잘못 조절하면 암^4,5를포함한 다양한 질병으로 이어질 수 있다. TGF-β 암 진행에 복잡 한, 이중 역할을 재생: 정상 및 premalignant 상피 세포에서, TGF-β 확산을 억제 하 고 세포 멸 각을 유도 하 여 종양 억제제로 행동^6,7; 그러나 종양 진행 후기 단계에서, 종양 억제유전자의 발병 또는 상실의 활성화에 의해 세포정전기 반응이 막힐 때, TGF-β 암세포에서 상피-중간엽 전이(EMT)를 촉진하여 종양 증강제역할을 하며, 이를 통해 암세포 침입 및 전이, 종양 종양 내 세포 에 작용, 면역 및^제90의세포에 작용한다.

TGF-β 성숙한 카박스-말기 TGF-β 및 대기 시간 관련 펩티드(LAP)^11을포함하는 비활성 전구체 분자로서 분비된다. 이 작은 복합체는 잠복 TGF-β 결합 단백질(LTBP)^12에의해 공유적으로 결합될 수 있다. 성숙한 TGF-β 방출은 LAP를 갈라놓는 특정 프로테아제의 작용또는 INtegrin^{의존공정(13,14)에서}LAP의 기계적 당기기에 의해 중재될 수 있다. LTBP 이외에, 당단백질 A 반복우세(GARP)는 규제 T 세포(Tregs)의 표면에 높게 발현되고 TGF-β^15,16의활성화를 조절하는 LTBP와 유사한 역할을 한다. GARP는 이황화 연결 및 비응성 협회를 통해 잠재 TGF-β 직접 결합합니다. GARP/TGF-β 복합체로부터 TGF-β 활성화하려면 통합이^{필요합니다(17)}. 성숙한 TGF-β TGF-β 세린/테로닌 키나아제 수용체, 즉 TGF-β 타입 I(TβRI) 및 TGF-β 타입 II(TβRII) 수용체(TβRII)^{수용체(TβRII) 수용체에} 결합하여 시그널링을 시작한다. TGF-β 결합은 TβRII에 대한 TβRI의 모집과 이종복합체의 형성을 촉진한다. 이어서, TβRI는 짧은 글리신 및 세린이 풍부한(GS) 모티프로 세린 및 티레오닌 잔류물에 TβRII 키나아제에 의해 인포화되어^19,20의활성화를 이룩한다. 활성화 시, 활성화된 TβRI는 기판을 모집하고 인광한다: SMAD2 및 SMAD3(그림1)를포함하는 2개의 수용체 특이적 SMADs(R-SMADs). R-SMADs는 프롤라인이 풍부한 링커영역(그림 2)으로구분되는 두 개의 소위 Mad homology 도메인인 MH1 및 MH2와 유사한 전체 구조를 공유합니다. SMAD3의 MH1 도메인 내의 DNA 결합 모티프는 SMAD2와 SMAD3 사이에 보존되지 않으며, SMAD2는 MH1 도메인(exon 3 및 L1)에 두 번의 삽입으로 인해 DNA를 직접 결합할 수 없습니다. SMAD2 및 SMAD3는 C-테르미니(그림2)에서SSXS 모티프의 인산화에 의해 활성화될 수 있다. 인광SMAD2/3 형태이종 복합체는 공통SMAD 중재자, SMAD4, 표적 유전자의 전사를 조절하기 위해 핵으로 배회(그림 1)^7,21. 이러한 정식 SMAD 신호 경로는 정확하게 조절되며 세포 운명 및 종양 세포 전이 및^{침입(22)의}조절과 같은 특정 세포 및 조직 반응을 생성한다. TGF-β-SMAD 시그널링 외에도, 비-SMAD 신호 경로는 또한 다운스트림 세포 반응을 조절하기 위해 수용체에 의해 직접 활성화될 수^있다(23).

종양 진행 중, TGF-β 유도된 SMAD 의존및 SMAD 독립적인 통로의 활성화는 EMT의 유도를 위해 필요하다. EMT는 종양 세포가 상피 표현형으로부터 분화되는 가역적 과정으로, 세포-세포 접촉의 손실과 지방-기저 극성 감소와 연관되어, 향상된 운동성 및 침입^{능력(24)을}가진 중간키말 표현형으로 분리된다. EMT는 N-카데린, 바이멘틴, Zeb2 및 달팽이1/2를 포함한 중간엽 마커 단백질의 발현이 증가하고, E-cadherin 및 β 카테닌(그림3)^25와같은 상피 마커의 수반되는 다운레코딩을 특징으로 한다. 그러나 상피에서 중간엽 상태로의 전환은 종종 불완전하며 세포는 혼합 상피 및 중간엽(E/M) 특성을 얻습니다. 국제 EMT 협회에 의해 최근 논문은 상피 – 중간 가소성 (EMP)^26로중간 E / M phenotypic 상태를 겪고 세포의 과정을 설명하기 위해 제안했다. 이러한 가소성은 부분 EMT, 하이브리드 E/M 상태, 메타안정 EMT 상태, EMT 연속체 및 EMT^{스펙트럼(26)을}지칭한다. EMT 동안, 종양 세포는 암 줄기 세포 (CSC) 특성을 얻고 분리 유도 된 세포멸에 더^{내성이된다(27)}. EMT는 1차 종양 세포에서 침습적 표현형의 획득을 담당하고 암 진행을 유도하는 반면, 중간엽 상피 전이(MET)는 먼 전이성^부위에서전파된 종양 세포의 성장에 중요한 역할을 하는 것으로^{나타났다.} 최근 연구에 따르면 EMT 유래 유방암 세포는 세포로 분화될 수 있으며, 이는 전이를 억제하고 종양 세포 및 재발된^{암(30)에서}치료 저항을 극복할 수 있는 기회를 제공할 수 있다. 유방 발암증에 있는 EMT의 활성화에 있는 TGF β 신호의 중요한 역할 때문에, 우리는 서양 블로팅에 대한 상세한 프로토콜을 제시, 루시파라제 전사 기자 분석, 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR), 및 TGF-β 신호의 조사를위한 면역 fluorescence, TGF-β 유도 EMT, 및 EMT 유래 murine 유방 epithelial 종양 세포의 과분화. 이 기술은 세포 생물학 필드에 있는 가장 일반적으로 이용된 분석 공구입니다. qRT-PCR은 정량적 방식으로 mRNA 발현 수준을 검출, 특성화 및 정량화하는 데 사용됩니다. 대체 기술인 정량PCR(qPCR)에 비해 역전사(RT)-PCR을 사용하여 반정성 방식으로 mRNA 발현을 결정할 수 있다^31,32. 서양 블로팅은 반정성 방식으로 감도 및 특이성의 장점을 갖는 주어진 세포 용해 시료의 특정 단백질 수준을 검사하는 데 사용됩니다. 따라서, 우리는 또한 그밖 신호 경로에 적용될 수 있는 TGF-β 신호신호를 조사하는 것을 돕기 위하여 유전자 발현에서 단백질 발현에 변경을 분석하는 체계적인 워크플로우를 제시합니다.

Protocol

1. 서양 블로팅을 사용하여 TGF β 유도 SMAD2 인산화 분석 참고: 선하성 인간 유방 MCF10A-Ras 세포는 TGF-β 신호 반응을 조사하는 예로 사용되었다33. 원칙적으로, 아래에 설명된 방법은 다른 TGF-β 반응형 세포주에도 적용됩니다. 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)/F12에서 37°C에서 유방 상피 세포주 MCF10A-Ras를 배양하여 5%의 말 세럼을 함유하고 있는 L-글루타민을 함유하고, 20 ng/mL 표피 성장 인자 (EGF), 10 mg/mL 인슐린, 100 ng/mL 콜레라 엔테토톡신, 0.5 mg/mL 하이드로코르티손, 1:100 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep). 1 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA의 1 mL로 MCF10A-Ras 세포를 트립시니징하고 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다. 5×105 세포의 밀도로 6 웰 플레이트로 종자 세포/ 잘. 하룻밤 동안 성장한 후, TGF-β(5 ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% 지방산 이없는 소 세럼 알부민(BSA))로 세포를 치료한 다음 배양 배지를 제거하고 인산염 완충식 염수(PBS)의 1mL로 두 번 부드럽게 세척한다. 얼음에 6웰 플레이트에 식힌 세포를 식히고 프리쿨드 무선 면역 강수량 분석(RIPA) 용해 버퍼(150mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50m Tris-HCls-HClpH PH pH 8, 50m TCls-HClpPH pH pH 8,0.0, 감산 제고)의 150 μL을 첨가합니다. 용해가 얼음위를 10분 동안 진행할 수 있도록 합니다. 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 고추 세포를 긁어 낸 다음 셀 현탁액을 미리 냉각 된 미세 원심 분리기 튜브로 부드럽게 옮기십시오. 원심분리기 세포는 4°C에서 150 원심력(xg)에서10분 동안 용액을 분리하고 상피관을 신선한 1.5mL 미세원심분리기로 이송한다. 세제 호환(DC) 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 각 시료로부터 단백질 30 μg를 10% 나트륨 도데실 황산폴리아크릴아미드 젤 전기포고증(SDS-PAGE) 젤에 적재하고 1.5-2시간 동안 100V의 전압으로 젤을 실행한다. 1-1.5시간 동안 110V의 전압으로 젤에서 45μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 전달한다. PVDF 멤브레인을 단백질 측(젤을 향하고 있던 측)을 가진 적절한 용기로 옮기고, 증류수에서 멤브레인을 잠시 헹구는다. 물을 버리고 Ponceau S 용액을 추가하고 멤브레인을 흔들 플랫폼에 1-2 분 동안 놓습니다. 신속하게 헹구고 1 분 동안 세척하여 증류수로 멤브레인을 염색하십시오. 그런 다음 PVDF 멤브레인을 라이트 박스에 넣고 사진을 찍어 동일한 총 단백질 로딩을 확인합니다. Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.1 % Tween 20)로 트리스 버퍼식 식염수로 멤브레인을 세척하여 눈에 띄는 염색이 없을 때까지 막을 씻으하십시오. 멤브레인을 블로킹 버퍼(TBST 용액의 탈지 우유 5%)에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. TBST로 멤브레인을 두 번 씻으시면 됩니다. 인-SMAD2(p-SMAD2; 1:1000, 홈메이드 34),총 SMAD2/3 1:1000 및 글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH; 1:1000)에 대한 1차 항체로 멤브레인을 4°C에서 하룻밤 사이에 배양한다. TBST로 멤브레인을 두 번 세척하고 2 시간 동안 토끼 또는 마우스 (1:5000)에 대한 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오. 웨스턴 ECL 기판으로 PVDF 멤브레인을 30초 동안 배양하고 이미징 시스템을 사용하여 신호를 감지합니다. 생물학적 삼중 생물을 얻기 위해 적어도 세 번 실험을 반복한다. 2. TGF-β 유도SMAD3 의존적 전사 반응 분석 SMAD3/SMAD4 의존CAGA12-luciferase 전사 기자 분석 작업을 수행합니다. 1단계에서 설명된 바와 같이 MCF10A-Ras 세포를 배양하고 트립시니화합니다. 5×104 세포/웰에서 24웰 플레이트로 세포를 종자 세포와 세포가 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 합니다. 시드 후, TGF-β/SMAD3-유도가능(CAGA) 12루시파아제 전사 기자의100 ng와 각각 의 세포를 폴리에틸렌민(PEI)을 이용한 β-갈라토시다제 발현 구조의35 및 80 ng를 구성한다. β 갈라콘토시다아제의 트랜스페싱은 서로 다른 우물 간의 트랜스포션 효율의 차이를 정상화하는 데 사용됩니다. 삼중으로 모든 실험 그룹을 설정합니다. 24시간 의 배양 후 혈청이 없는 DMEM-높은 포도당을 가진 세포를 굶주리고, 6시간 후에는 TGF-β(5 ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% BSA)를 세포에 차량 제어로 첨가한다. 또 다른 24 시간 의 배양 후, 미리 따뜻해진 PBS로 두 번 세포를 씻으시다. 120 μL/잘 1× 용해 버퍼를 넣고 4°C에서 20분간 부드럽게 흔들어 줍니다. 30 μL의 용액을 96웰의 흰색 분석 마이크로플레이트의 각 웰에 전송하여 발광계를 사용하여 루시파아제 활성을 측정합니다. β-갈라코시다제 활성을 측정하기 위해 96웰투명 플레이트의 각 웰에 50 μL의 lysate를 전송합니다. β-갈라콘토시다아제 활성으로 루시파라제 활성을 정상화하고 생물학적 삼중생물을 얻기 위해 적어도 세 번 실험을 반복한다. 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 TGF-β 표적 유전자의 발현을 분석한다. 1단계에서 설명된 바와 같이 MCF10A-Ras 세포를 배양하고 트립시니화합니다. 5×105 세포 /웰에서 6 웰 플레이트로 세포를 종자 세포와 세포가 하룻밤 동안 부착 할 수 있습니다. TGF-β(5 ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% BSA)를 6시간 동안 처리한 다음 PBS 1mL로 두 번 세포를 세척합니다. RNA 격리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리합니다. 나노드롭을 사용하여 RNA 농도를 결정하고 제1 가닥 cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA 1 μg로 cDNA 합성을 수행한다. 실시간 PCR 검출 시스템을 사용하여 GAPDH를 위한 특정 인간 전방 및 역 프라이머를 포함하는 10μL 반응 혼합물에서 10배 희석 된 cDNA를 가진 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행하십시오(정규화용), SERPINE1(PAI-1 단백질, TGF-β/SMAD 표적 유전자) ,SMAD7(TGF β-β/SMAD 표적 유전자)를 포함한다. 삼중으로 모든 실험 그룹을 설정합니다.참고: qRT-PCR에서 표적 인간 유전자를 검출하는 데 사용되는 프라이머 서열은 표 1에나열됩니다. 다음 qPCR 반응 조건을 사용하십시오: 초기화, 3분 동안 95°C; 10초 동안 95°C; 어닐링, 60°C 30초; 및 확장, 10초 동안 80°C; 데니션, 어닐링 및 확장은 40회 반복된다. 생물학적 삼중 생물을 얻기 위해 적어도 세 번 실험을 반복한다. 3. TGF β 유도 EMT의 분석 서양 블로팅을 사용하여 단백질 수준에서 EMT 마커의 발현을 분석합니다.참고: TGF-β 유도 된 EMT의 분석은 마우스 NMuMG 상피 세포를 예로 사용하여36,37을나타내고 있다. 배양 NMuMG 세포는 DMEM-높은 포도당 배지에서 37°C에서 10% 태아 소 혈청과 1:100 펜-스트렙으로 보충하였다. 단백질 절연 및 검출을 위해 1단계에서 설명된 방법을 사용합니다.참고: 다음 항체는 이 실험에서 사용됩니다: E-cadherin, 1:1000; N-카데린, 1:1000; 달팽이, 1:1000; 슬러그, 1:1000; 튜부린, 1:1000(그림 3). 2.2단계에 설명된 바와 같이 정량적 실시간 PCR을 사용하여 mRNA 수준에서 EMT 마커의 발현을 분석한다.참고: CDH1(E-cadherin 단백질 인코딩), 달팽이 및 ZEB2(그림 3)를포함한 qRT-PCR에 사용되는 모든 마우스 프라이머가 표 1에나열되어 있다. 간접 면역 형광 및 직접 형광 염색을 사용하여 EMT 공정을 분석합니다. E-카데린의 간접 면역 형광 염색 멸균 18mm 사이드 스퀘어 글래스 커버립을 6웰 플레이트(웰당 1개의 커버슬립)에 놓습니다. 종자 1×105 NMuMG 세포는 6웰 플레이트 당 완전한 DMEM2 mL을 가지고 있으며 세포가 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 합니다. 부착 셀이 있는 커버립을 새로운 6웰 플레이트로 부드럽게 이동하고 우물에 배양 배지 2mL을 추가합니다. 2일 동안 TGF-β(5ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% BSA)로 세포를 치료한다. 배양 배지를 제거하고 예동 PBS 1mL로 셀을 두 번 부드럽게 씻으십시오. 4% 파라포름알데히드의 1mL을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 그런 다음 PBS 1mL로 셀을 두 번 부드럽게 씻으십시오. 0.1% 트리톤 X-100으로 고정된 세포를 실온에서 10분 동안 과미화하고 PBS로 셀을 두 번 세척합니다. 실온에서 1 시간 동안 PBS에서 5 % BSA로 세포를 차단하고 PBS로 두 번 세포를 씻으시다. E-cadherin에 대 한 기본 항체를 추가 (희석 1:1000 PBS에서) 각 커버 슬립의 상단에 실온에서 1 시간 동안 배양. 1차 항체를 제거하고 PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다. 알렉사 플루오 555 이차 항체(PBS에서 희석1:500)를 각 커버슬립의 상단에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다. 이차 항체를 제거하고 PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다. 커버슬립(아래쪽을 향한 셀)을 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착하고 빛으로부터 보호되는 4°C의 상자에 장착된 슬라이드를 보관합니다. SP8 공초점 현미경으로 염색을 관찰하십시오. 필라멘트 (F)-액틴의 직접 형광 얼룩. 3.3.1.1 단계를 따라 샘플을 준비합니다. 3.3.1.9로. 알렉사 플루어 488 Phalloidin을 추가하여 세포를 얼룩 488 Phalloidin (1:1000) 에 대한 1 어둠 속에서 실온에서 1 시간 필라멘트 액틴을 시각화 (F-actin). PBS로 셀을 세 번 씻습니다. DAPI장착 매체를 사용하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 SP8 공초점 현미경으로 이미지를 찍습니다.

Representative Results

TGF β 신호 분석TGF-β 시그널링의 핵심 단계는 TβRI 키나아제(TβRI kinase38,39)에의해 SSXS 모티프(그림2)에서가장 많은 카복시 단자 세린 잔류물의 인광화이다. TGF-β 신호 반응을 조사하기 위해, 우리는 인으로 SMAD2의 서양 블로팅을 수행. 선불인간 유방 MCF10A-Ras 세포에서, SMAD2의 인광은 1시간 동안 TGF-β 자극에 반응하여 크게 증가했으며, 총 SMAD2/3의 발현은 TGF-β 치료에 의해 영향을 받지 않았다(도 4A). TGF-β 유도된 SMAD3/4-driven CAGA-luc 전사 기자 분석서를 사용함으로써, TGF-β 비처리세포(도 4B)에비해 MCF10A-Ras 세포 선에서 루시파라제 기자를 현저하게 유도한 것으로 나타났습니다. 더욱이, 우리는 SMAD7 및 SERPINE1 (PAI-1 단백질을 인코딩)를 포함하여 TGF-β 잘 특징적인 직접 전사 유전자 표적이 TGF-β 처리된 MCF10A-Ras 세포(도4C)에서높게 발현되었다는 것을 관찰했습니다. TGF-β 유도 EMT의 분석우리는 형태학적 변화, mRNA에서 EMT 마커의 발현 및 EMT 마커의 면역 형광 염색 과 같은 다양한 방법으로 TGF-β 유도 된 EMT를평가했다 36. 1 및 2 일 동안 TGF-β 처리 된 NMuMG 상피 세포는 상 대비 현미경 검사법(도 5A)에의해 표시된 바와 같이 고전적인 상피 형태에서 스핀들 모양의 중간 엽과 같은 형태로 변경되었습니다. 형태학적 변화에 따라, 우리는 TGF-β 치료가 N-cadherin, 달팽이 및 슬러그(도 5B)를포함하여 중간 엽 마커의 단백질 발현의 증가를 주도것을 관찰했다. 대조적으로, 상피 마커인 E-cadherin은 TGF-β처리(도 5B)의2일 후에 NMuMG 세포에서 다운조절하였다. 또한, EMT 마커의 유전자 발현을 조사하기 위해 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 수행하였다. CDH1(E-cadherin 단백질인코딩)은 현저히 감소하였고, 달팽이 및 아연 핑거 E-박스 결합 동종상자 2(ZEB2)와 같은 중간엽 마커는 치료되지 않은 세포에 비해 NMuMG 세포에서 TGF-β 자극 후 현저하게 증가하였다(도5C). NMuMG 세포에서 TGF-β 유도 된 EMT는 E-cadherin의 면역 형광 염색에 의해 더 확인되었다. 2일 동안 TGF-β 자극시, NMuMG 세포는 공초점 현미경검사(도5D)에의해 분석된 바와 같이 유도되지 않은 대조군에서 세포보다 E-cadherin을 적게 발현하였다. 더욱이, NMuMG 세포는 TGF-β 존재하여 더 많은 액틴 스트레스 섬유를 형성하였습니다, 공초점 현미경 검사법에 의해 도시된 바와 같이(도 5E). SB431542 및 GW788388은 TGF β 신호 및 TGF-β 유도 EMT를 억제합니다.SB431542는 TβRI의 키나아제 도메인의 ATP 경쟁 억제제이며, 또한 활성수용체와 같은 키나아제 5(ALK5)라고 불리우며, GW788388은 TβRI 및 TβRII 키나아제 활성을 억제한다. 두 억제제 모두 TGF-β 수용체신호(40)를억제할 수 있다. 따라서, 우리는 1 시간 동안 TGF-β 존재하여 GW788388의 상이한 농도를 가진 NMuMG 세포를 처리했습니다. 예상대로, GW788388은 용량 의존형 방식으로 TGF-β 유도SMAD2 인산화를 억제하였다(도6A). 또한, SMAD2의 TGF-β 매개 인산화는 SB431542처리(도 6A)에의해 차단되었다. 인광SMAD2/3은 SMAD4를 가진 이종성 복합체를 형성하고 표적 유전자의 전사를 조절하기 위하여 핵으로 전염됩니다. 따라서, 우리는 SMAD2/3의 면역 형광 염색에 의해 NMuMG 세포에서 SMAD2/3의 전좌를 조사했습니다. 이 데이터는 SB431542 와 GW788388이 NMuMG 세포에서 TGF-β 유도된 핵 전좌 및 SMAD2/3의 축적을 현저히 억제한 것으로나타났습니다(도 6B). 더욱이, SB431542 및 GW788388의 억제 효과는 PAI-1,달팽이, E-cadherin 및 Fibronectin (도 6C)을포함하여 EMT에 관여하는 중요한 TGF-β 표적 유전자의mRNA 발현 수준에서 도 6C로 관찰되었다. 이러한 데이터는 SB431542 및 GW788388 TGF-β 신호 및 TGF-β 유도 EMT를 차단 제안. 중간 엽 유방암 세포의 세포화 의 분석EMT는 암에 있는 세포 가소성을 향상에 있는 중요한 역할을 하고 치료 저항의 발달에 초래합니다. 암세포 가소성은 강제멸광발생(30)과같은 트랜스 분화 접근법으로 직접 표적화및 억제될 수 있다. 우리는 PY2T 뮤린 유방암 세포를 사용했는데, 이는 마우스 유방 종양 바이러스-폴리마 중형 종양 항원(MMTV-PyMT) 형질성 마우스의 유방 선에서 유래되었으며, EMT 유도 암 세포 가소성의 세포 모델로서 사용하였다. 확립된프로토콜(41)에기초하여, 우리는 EMT 유래 Py2T 뮤린 유방암 세포를 항당뇨병 치료제 로시글리타존과 함께 10일 동안 치료하여 증식을 유도하였다. 아디포게네스는 오일 레드 O 염색을 사용하여 지질 방울을 시각화하여 평가되었다. 지방세포는 로시글리타존처리된 Py2T 뮤린 유방암세포(도7)에서쉽게 검출되었으며, 이는 로시글리타존만으로는 EMT 유래 유방암 세포의 전분적 분화를 촉진하기에 충분하다는 것을 입증하였다. 그림 1: TGF-β/SMAD 신호. TGF-β 신호는 TGF-β 타입 II 수용체(TβRII)에 TGF-β 결합을 시작하여, 구성적으로 활성 키나아제, 즉 인광TGF-β 타입 I 수용체(TβRI)를 개시한다. 이어서, 활성화된 TβRI 키나아제 인산SMAD2/3. 2개의 카박스단 인광세린 잔류물을 가진 SMAD2의 SSXS 모티브를 함유한 펩타이드는 인광-SMAD2(p-SMAD2)를 인식하는 폴리클론 항세라를 얻기 위해 사용되었다. 따라서, 서양 블로팅에 의한 p-SMAD2 발현의 분석은 TGF-β 신호 경로의 활성화를 결정하는 데 사용될 수 있다. 인광SMAD2/3은 SMAD4를 사용하여 이종 복합체를 형성할 수 있으며, 이 단지는 전사 반응을 조절하기 위해 핵으로 배회할 수 있습니다. SMAD7 및 SERPINE1(PAI-1 단백질 인코딩)과 같은 TGF-β 표적 유전자의 mRNA 발현에 대한 CAGA 12-루시포라이 리포터 분석 및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)은 TGF-β 유도 SMAD3-의존적 전사 반응을 분석하는 데 사용될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: R-SMADs(SMAD2 및 SMAD3)의 회로도 구조. MH1(파란색) 및 MH2(노란색) 도메인은 R-SMAD 간에 보존되지만 링커 영역(회색)은 보존되지 않습니다. SMAD3의 MH1 도메인은 DNA 결합 모티프를 품고 있으며, SMAD2는 MH1 도메인에 삽입(엑슨 3)으로 인해 DNA를 직접 결합할 수 없습니다. MH2 도메인은 SMAD 올리고머화, TGF-β 수용체와의 상호 작용 및 단백질 결합을 중재하며 전사 조절에 관여합니다. SMAD2 및 SMAD3는 C 테르미니에서 SSXS 모티프(빨간색)의 인광에 의해 활성화될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 3: TGF-β 유도 EMT. TGF-β 유도 된 상피 – 중간 엽 전이 (EMT) 동안, 세포는 향상된 세포 운동성 및 침입 능력과 중간 엽 특성의 상피 및 획득의 손실을 겪습니다. EMT의 유도는 N-cadherin, Zeb2 및 Snail1/2와 같은 중간엽 마커의 발현뿐만 아니라 E-cadherin, β-카테닌 및 클라우디엔-1을 포함한 상피 마커의 하향 조절으로 이어집니다. 상피/중간엽(E/M) 특성의 축적된 손실 또는 이득은 세포가 가역적인 방식으로 중간 상태로 진입하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: MCF10A-Ras 세포에서 TGF-β 신호 반응. (A)MCF10A-Ras 세포는 TGF-β(2.5 ng/mL)의 유무에 관계없이 1시간 동안 처리되었고, 세포 용액은 인광SMAD2(p-SMAD2), 총 SMAD2/3 및 GAPDH(로딩 컨트롤로서)에 대해 면역계로 정하였다. 크기 마커가 오른쪽에 표시됩니다. 단점: TGF-β 치료 없이 제어 그룹. (B)MCF10A-Ras 세포에서 SMAD3-SMAD4 의존CAGA 12-루시파라제(LUC) 전사 기자를 이용한 TGF-β(5 ng/mL) 활성분석. 값은 β-갈라콘토시다아제(βGal) 활성으로 정규화된다. 데이터는 s.d, n = 3의 평균 ± 표현됩니다. 학생의 t 시험, ***P ≤ 0.001(C)qRT-PCR 분석은 TGF-β 표적 유전자 SMAD7 및 SERPINE1 (PAI-1 단백질을 인코딩) MCF10A-Ras 세포에서 TGF-β (2.5 ng/mL)로 6 시간 동안 치료하였다. GAPDH는 내부 제어로 사용되었습니다. 데이터는 s.d, n = 3의 평균 ± 표현됩니다. 학생의 테스트, ***P ≤ 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 5: NMuMG 세포에서 TGF-β 유도 EMT. (a)TGF-β(2.5 ng/mL)로 처리된 NMuMG 세포의 형태는 1 또는 2일 동안. TGF-β 존재, NMuMG 세포는 중간 엽 표현형으로 분화. 스케일 바 = 150 μm(B)NMuMG 세포는 2 일 동안 TGF-β (5 ng/mL)의 유무에 관계없이 처리되었으며, EMT 마커는 서양 블로팅에 의해 분석되었다. 크기 마커는 오른쪽에 표시된 대로 표시됩니다. 단점: TGF-β 치료 없이 제어 그룹. (C)NMuMG 세포에서 EMT 마커(CDH1(E-cadherin 단백질인코딩)의 유전자 발현분석, 달팽이 및 ZEB2)를 TGF-β(5 ng/mL)로 2일 동안 치료하였다. GAPDH는 내부 제어로 사용되었습니다. 결과는 평균 ± s.d., n = 3로 표현됩니다. 학생의 t-테스트, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, *P ≤ 0.001. (D)NMuMG 세포는 TGF-β(2.5 ng/mL) 처리 후 상피 마커 E-cadherin(red)의 발현을 검출하기 위해 면역형광에 의해 염색되었다( 2.5 ng/mL) 처리. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색되었다. 이미지는 공초점 현미경 검사법으로 캡처되었습니다. 스케일 바 = 50 μm(E)NMuMG 세포는 F-액틴을 시각화하기 위해 플루오레세인-플라로이드(green)로 염색하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색되었다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 6: TGF-β시그널링 및 TGF-β 유도 EMT는 SB431542 및 GW788388에 의해 억제되었다. (A)NMuMG 세포는 1시간 동안 TGF-β(5 ng/mL)의 존재 또는 부재에서 SB431542(SB) 또는 GW788388(GW)의 표시 농도10μM로 처리되었다. 세포 용해는 p-SMAD2, SMAD2/3 및 GAPDH를 위해 면역블레드되었다. (B)NMuMG 세포는 SMAD2/3(green)의 핵 전좌를 검출하기 위해 면역불과민증에 의해 염색된 TGF-β 5ng/mL의 존재 또는 부재에서 GW788388(GW)의 5μM(SB) 또는 10μM(GW)으로 처리되었다. 이미지는 공초점 현미경 검사법으로 캡처되었습니다. (C) SNAIL, E-Cadherin 및 Fibronectin을 포함한 PAI-1 및 EMT 마커를 코딩하는 유전자를 포함한 TGF-β 표적 유전자의 발현은 SB 또는 GW β 치료 후 NMuMG 세포에서 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 48시간 동안 분석하였다. GAPDH는 로딩 제어 역할을 했습니다. 제어는 처리되지 않은 세포를 나타냅니다. 이 그림은 피터슨 M. 외에서수정되었습니다. 34 게시자의 허락을 받아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 7: EMT 유래 Py2T 뮤린 유방암 세포는 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. Py2T 뮤린 유방암 세포는 완전한 EMT를 유도하기 위해 20 일 동안 2 ng/mL TGF-β 자극되었다. 이어서, 세포는 비관성 암세포의 분화를 허용하고 송포발생을 유도하기 위해 10일 동안 DMSO를 차량 제어 또는 로시글리타존(2 μM)으로 치료하였다. 배지는 2일마다 변경되었습니다. 치료 10 일 후, 세포는 기름 적색 O. 스케일 바 = 50 μm로 염색하였다. 종 유전자 이름 전진 (5’~ 3′) 역(5’에서 3′) 사람의 GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGGGTGGTCATGAG SMAD7 TCCAGATGCTGTGCCTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG 세르피인1 카카오카가CGGCACT 캣CGGGCGTGGTGAACTC 마우스 GAPDH TGGCAAAGTGG가트GTTGCC 아가그게트가그GCTTCCCG CDH1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC 가가트GTACTTGGCAATGG 달팽이 카GCTGGCCAGGCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA ZEB2 TTCTGCAGCCTCTGTAGGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCAT 표 1: qRT-PCR에 사용되는 프라이머.

Discussion

TGF-β/SMAD 시그널링은 EMT^7을유도하여 유방암 세포 침습성 및 전이를 촉진할 수 있기 때문에 유방암 진행에 중추적인 역할을 한다. 여기서, 우리는 SMAD 중재 전사 및 생물학적 반응에 수용체 유도 SMAD 활성화에서 TGF-β 시작된 신호를 조사하기 위하여 논리적인 워크플로우를 기술했습니다. 우리는 SMAD2 인산화의 분석을 기술함으로써 시작, TGF-β 유도 SMAD3 의존 전사 반응 과 EMT 마커 발현 모두 유전자와 단백질 수준에서 계속 TGF-β/SMAD 신호 반응을 분석하였고, 마지막으로 TGF-β 유도 EMT를 검사하였다. 우리는 PAI-1 프로모터로부터 파생된 CAGA 상자를 포함하는 CAGA 12-루시파아제 전사 기자를 사용하여 TGF-β/SMAD 시그널링^{경로(35)의}활성을 모니터링하였다. 이 리포터 구성은 정품 인증을 위해 SMAD3 및 SMAD4가 필요합니다. 이전 연구는 SMAD4의 녹다운 TGF-β 유도 CAGA₁₂-luciferase 활동³⁷을 감쇠 것으로 나타났습니다. SMAD2 및 SMAD3를 포함한 내인성 SMADs의 인산화 상태를 결정하는 기자 분석 외에도 TGF-β 시그널링 반응을 조사하는 또 다른 방법이다. 실제로, TGF-β 가족의 다른 구성원, 성장 및 분화 인자 (GDF)-8/myostatin 및 GDF-9와 같은, 또한 TβRI를 참여시켜 SMAD2/3 단백질을 통해 신호를 트랜스듀스^42,43,44. CAGA_{12-luciferase}기자 이외에, 몇몇 유사한 기자는 TGF-β 신호의 활성화를 검출하기 위하여 이용되었습니다. 예를 들어, JunB 프로모터로부터 유래된 반응 요소를 가진 전사(SBE)_4-Lux리포터는 TGF-β, 활성 및^BMPs(45)에의해 효율적으로 유도될 수 있다.

서양 블로팅 및 qPCR은 상피 마커 (즉, E-cadherin) 및 중간 엽 마커 (즉, N-cadherin, 달팽이, 슬러그 및 Zeb2)의 발현을 조사하는 고전적인 방법입니다 TGF-β 유도 EMT를 분석하는 데 사용되었다. 우리는 또한 E-카데린의 간접적인 면역 형광 염색 및 F-actin의 직접적인 형광 염색을 수행했습니다. 이러한 assays는 TGF-β 치료 후 세포의 중간 엽 표현형을 더욱 검증하였다. 면역형광 염색의 한계는 세포가 항체와 화상 진찰을 가진 잠복하기 전에 고정될 필요가 있고, 살아있는 세포에 있는 EMT 마커 발현에 있는 변경을 조사하기 어렵다는 것입니다. 최근에는 A549 폐 아데노암-비멘틴-RFP와 같은 EMT 리포터 세포주 설계를 통해 적색 형광단백질(RFP)의 발현을 통해 상피세포의 중간경세포 로의 변혁을 실시간으로 모니터링할 수 있게 되었다. 이 플랫폼은 약물 검진 및 신약 개발에 활용될 수 있다^46. 생활 세포에서 F-액틴 구조를 더럽히수 있는 17아미노산 펩타이드인 LifeAct 염료는 세포 과정을 방해하지 않고 실시간으로 액틴 세포골격을 시각화하는 귀중한 도구가 되고^있다(47). 이 연구에서는, 우리는 두 개의 작은 분자 억제제사용, SB431542 및 GW788388, TGF-β 신호 및 TGF-β 유도 된 EMT에 그들의 억제 효과 확인. 특히, GW788388은 TβRI 및 TβRII 활성을 강력하게 억제하고, SB431542는 TβRI(및 ALK4 및 ALK7)에만 억제 효과를 갖는다. 이전 연구에 따르면 GW788388은 SB431542^40보다 생체 내에서 더 강력하다. EMT의 억제 외에도 GW788388은 신장내섬유증 마커의 발현을 감소시키고, 당뇨병 마우스에서 GW788388의 경구 투여를 현저히 감소시켜^25,48.

EMT는 암세포 가소성을 증진하는 데 필수적인 역할을 하며 약물 내성 및 ^{전이(49)를}초래한다. 따라서, 특정 세포독성^{약물(50)을} 가진 EMT 유래 세포를 표적으로 하거나 중간엽-상피 전이(MET)^51을 통한 재분화를 유도하는 것은 암세포 전이 및 치료 저항을 극복하기 위한 접근법으로 제안되고 있다. 그러나, MET는 EMT의 치료 적 회귀를 사용할 때 비생산적 일 수 있는 먼^{장기(52)에서}전파된 암세포의 증식에 기여한다. 최근에는 EMT 유래 유방암 세포를 직접 표적화하여^{아디포세포(30)로}분화하여 치료적 이분화 접근법을 보고하였다. 이셰이 로넨 등의 연구. al.^30은 TGF-β 장기 치료에 응하여 중간엽 세포로의 전환을 겪은 Py2T 뮤린 상피 암세포를 사용하였다. 그(것)들은 MEK 억제제와 조합하여 rosiglitazone 향상된 상피 분화 및 선포발생을 증명했다. 그러나, 우리는 rosiglitazone 혼자 백석 Py2T 뮤린 세포의 전분을 증분세포로 유도하기에 충분하다는 것을 것을을 발견했습니다.

요약하자면, 이 연구에서 사용된 방법은 TGF-β 시그널링 및 TGF-β 유도된 EMT를 조사하기 위한 논리적 워크플로우를 제공했습니다. 두 억제제, SB431542 및 GW788388, TGF-β 유도 된 응답 및 EMT를 차단할 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 로시글리타존만이 특정 TGF-β 유도된 중간엽 유방암 세포에서 염분신생을 유도한다는 것을 입증하였다. 비록 우리가 TGF-β 반응을 조사하기 위하여 몇몇 유방암 세포 주를 사용하더라도, 여기에서 기술된 방법은 그밖 (암) 세포로 추정될 수 있었습니다. 여기에서, 우리는 세포 반응을 유도하기 위하여 각종 TGF-β 농도를 이용했습니다. 대부분의 세포 유형에서, TGF-β 0.01-10 ng/mL^53의 농도 범위에서 그것의 생물학적 활성을 발휘 하 고 복용량 응답 패턴에서 신호를 유도. 1차 내피 세포에서는 소 대동맥 내피 세포를 포함한 TGF-β 0.025 ng/mL에서 인광SMAD2의 실질적인 발현을 유도하고, 0.25 ng/mL에서 최대에 도달하고, 높은 농도^53에응답하여 이 수준에 머물렀다. 우리의 연구에서, 우리는 강한 응답을 얻기 위해 전사 기자 분석에 대한 MCF10A -Ras 세포에서 TGF-β (5 ng/mL)의 고농도를 사용했다. SMAD2 인산화 및 표적 유전자 발현은 낮은 용량에서 TGF-β 의해 유도될 수 있다; 따라서, 우리는 세포를 치료 하기 위해 2.5 ng/mL TGF-β 사용. 그러나, 가장 적합한 작업 농도는 세포 유형 및 추정 효과에 따라 달라집니다. TGF-β 최고의 농도 를 결정 하려면, 다른 복용량으로 세포를 치료 (낮은에서 높은) 권장.

Materials

Reagent
18 mm-side square glass coverslips	Menzel Gläser	631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21422
Anti-E-cadherin antibody	BD Biosciences	610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody	Merck Millipore	MAB374
Anti-N-cadherin antibody	BD Biosciences	610920
Anti-Slug antibody	Cell Signaling Technology	9585
anti-SMAD2/3 antibody	Becton Dickinson	610842
Anti-Snail antibody	Cell Signaling Technology	3879
Anti-Tubulin antibody	Cell Signaling Technology	2148
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Cholera enterotoxin	Sigma-Aldrich	C8052
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705060
DC protein assay kit	Bio-Rad	5000111
DMEM-high glucose	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM-high glucose medium	Thermo Fisher Scientific	11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12	Thermo Fisher Scientific	11039047
epidermal growth factor (EGF)	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum (FBS)	BioWest	S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix	PROMEGA	A600X
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	26050088
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
NucleoSpin RNA II kit	BIOKE´	740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Thermo Fisher Scientific	15140148
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck Millipore	IPVH00010
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	K1621
Skimmed milk	Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001402
CFX Connect Detection System	Bio-Rad	1855201
Luminometer	Perkin Elmer	2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND-2000