Studio della segnalazione β TGF e della transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF-β nel cancro al seno e nelle cellule normali

Summary

Descriviamo un flusso di lavoro sistematico per indagare la segnalazione di TGF-β e l’EMT indotto da TGF-β studiando l’espressione proteica e genica coinvolta in questa via di segnalazione. I metodi includono western blotting, un saggio di reporter luciferasi, qPCR e colorazione immunofluorescenza.

Abstract

Trasformare il fattore di β (TGF-β) è un fattore multifunzionale secreto che svolge un ruolo chiave nella comunicazione intercellulare. Le perturbazioni del segnale TGF-β possono portare al cancro al seno. TGF-β provoca i suoi effetti sulla proliferazione e differenziazione attraverso specifici recettori della superficie cellulare TGF-β di tipo I e di tipo II (cioè TβRI e TβRII) che contengono un dominio intrinseco serina/treonina chinasi. Dopo la formazione complessa eteromerica indotta da TGF-β, il TβRI attivato provoca la segnalazione intracellulare fosforilando SMAD2 e SMAD3. Questi SMAD attivati formano complessi eteromerici con SMAD4 per regolare specifici geni bersaglio, incluso l’inibitore dell’attivazione del plasminogeno 1 (PAI-1, codificato dal gene SERPINE1). L’induzione della transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) consente alle cellule tumorali epiteliali nel sito primario o durante la colonizzazione in siti lontani di ottenere un fenotipo invasivo e guidare la progressione tumorale. TGF-β agisce come un potente induttore dell’invasione del cancro al seno guidando l’EMT. Qui descriviamo metodi sistematici per indagare la segnalazione TGF-β e le risposte EMT utilizzando cellule MCF10A-RAS (M2) umane premalignanti e cellule epiteliali NMuMG del topo come esempi. Descriviamo metodi per determinare la fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β mediante soffiatura occidentale, attività trascrizionale dipendente da SMAD3/SMAD4 utilizzando l’attività del reporter luciferasi e l’espressione genica bersaglio SERPINE1 mediante reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR). Inoltre, vengono descritti metodi per esaminare l’EMT indotta da TGF-β misurando i cambiamenti nella morfologia, nell’espressione del marcatore epiteliale e mesenchimale, nella colorazione dell’actina filamentosa e nella colorazione dell’immunofluorescenza dell’E-cadherina. Due inibitori selettivi della chinasi del recettore TGF-β a piccola molecola, GW788388 e SB431542, sono stati utilizzati per bloccare la fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β, geni bersaglio e cambiamenti nell’espressione marcatore EMT. Inoltre, descriviamo la transdifferenziazione delle cellule tumorali epiteliali murine Py2T del seno mesenchimale in adipociti. I metodi per esaminare la segnalazione indotta β TGF e l’EMT nel cancro al seno possono contribuire a nuovi approcci terapeutici per il cancro al seno.

Introduction

La citochina che trasforma il fattore di crescita-β (TGF-β) è il prototipo di un grande gruppo di polipeptidi regolatori strutturalmente e funzionalmente correlati tra cui TGF-βs (cioè TGF-β1, -β2 e -β3), proteine morfogeniche ossee (BMP) e attività^1,2. Queste citochine svolgono tutte ruoli importanti nello sviluppo embrionale e nel mantenimento dell’omeostasi dei tessuti e degli organi³. L’errata regolamentazione del TGF-β può portare a una grande varietà di malattie, tra cui il^{cancro 4,5}. Il TGF-β svolge un ruolo complesso e duale nella progressione del cancro: nelle cellule epiteliali normali e premalignanti, il TGF-β si comporta come un soppressore del tumore inibendo la proliferazione e inducendo apoptosi^6,7; tuttavia, nella fase avanzata della progressione tumorale, quando le risposte citostatiche sono bloccate dall’attivazione di oncogeni o dalla perdita di geni soppressori del tumore, TGF-β agisce come potenziatore tumorale promuovendo la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nelle cellule tumorali, consentendo così l’invasione e la metastasi delle cellule tumorali, agendo sulle cellule nel microambiente tumorale e stimolando l’angiogenesi e l’evasione^{immunitaria 8,9,10}.

Il TGF-β è secreto come una molecola precursore inattiva contenente il TGF-β carbossi-terminale maturo e il peptide associato alla latenza (LAP)¹¹. Questo piccolo complesso può essere legato covalentemente da una proteina latente TGF-β-legante (LTBP)¹². Il rilascio di TGF-β maturo può essere mediato dall’azione di proteasi specifiche che scindono LAP o dalla trazione meccanica di LAP in un processo dipendente dall’integrina^13,14. Oltre alla LTBP, la glicoproteina A ripetizioni predominanti (GARP) è altamente espressa sulla superficie delle cellule T regolatorie (Tregs) e svolge un ruolo simile a LTBP nella regolazione dell’attivazione di TGF-β^15,16. GARP si lega direttamente al TGF-β attraverso il legame disolfuro e l’associazione non covalente. L’attivazione di TGF-β dal complesso GARP/TGF-β richiede integrine¹⁷. Il TGF-β maturo si lega ai recettori TGF-β serina/treonina chinasi, cioè TGF-β tipo I (TβRI) e TGF-β recettori di tipo II (TβRII)^{18 per} avviare la segnalazione. Il legame del TGF-β a TβRII promuove il reclutamento di TβRI e la formazione di un complesso eteromerico. Successivamente, il TβRI viene fosforilato dalla TβRII chinasi su residui di serina e treonina in un breve motivo ricco di glicina e serina (GS), con conseguente attivazione^19,20. Al momento dell’attivazione, tβRI attivato recluta e fosforilati i suoi substrati: i due SMAD specifici del recettore (R-SMAD) che includono SMAD2 e SMAD3 (Figura 1). Gli R-SMAD condividono una struttura complessiva simile con due cosiddetti domini di omologia mad, MH1 e MH2, separati da una regione di linker ricca di proline (Figura 2). Il motivo di legame del DNA all’interno del dominio MH1 di SMAD3 non è conservato tra SMAD2 e SMAD3, e SMAD2 non può legare direttamente il DNA a causa di due inserimenti nel suo dominio MH1 (esone 3 e L1). SMAD2 e SMAD3 possono essere attivati dalla fosforilazione del motivo SSXS nei loro C-termini (Figura 2). L’SMAD2/3 fosforilato forma complessi eteromerici con un comune mediatore SMAD, SMAD4, che si trasferisce nel nucleo per modulare la trascrizione dei geni bersaglio (Figura 1)^7,21. Questa via di segnalazione SMAD canonica è regolata con precisione e genera risposte cellulari e tissutali specifiche come la regolazione del destino cellulare e della metastasi delle cellule tumorali^{e l’invasione 22}. Oltre alla segnalazione TGF-β-SMAD, le vie di segnalazione non SMAD possono anche essere attivate direttamente dai recettori per regolare le risposte cellulari a^{valle 23}.

Durante la progressione tumorale, sono necessarie l’attivazione di percorsi SMAD-dipendenti da TGF-β e indipendenti da SMAD per l’induzione dell’EMT. L’EMT è un processo reversibile in cui le cellule tumorali disferenziano da un fenotipo epiteliale, che è associato alla perdita di contatti cellulare-cellula e alla diminuzione della polarità apicale-basale, a un fenotipo mesenchimale con maggiore motilità e capacità di invasione²⁴. L’EMT è caratterizzato da una maggiore espressione delle proteine marcatori mesenchimali, tra cui N-cadherina, vimentina, Zeb2 e Lumaca1/2, e dalla concomitante downregolazione dei marcatori epiteliali, come E-cadherina e β-catenina (Figura 3)²⁵. Tuttavia, la transizione da uno stato epiteliale a uno mesenchimale è spesso incompleta, e le cellule acquisiscono caratteristiche epiteliali e mesenchimali miste (E/M). Un recente documento dell’associazione internazionale EMT ha proposto di descrivere il processo delle cellule sottoposte a stati fenotipici intermedi E/M come plasticità epiteliale-mesenchimale (EMP)²⁶. Questa plasticità si riferisce a EMT parziale, uno stato E/M ibrido, uno stato EMT metastabile, un continuum EMT e uno spettro EMT²⁶. Durante l’EMT, le cellule tumorali acquisiscono proprietà delle cellule staminali tumorali (CSC) e diventano più resistenti all’apoptosi indotta dal^{distacco 27}. Mentre l’EMT è responsabile dell’acquisizione di un fenotipo invasivo nelle cellule tumorali primarie e guida la progressione del cancro, al contrario, la transizione mesenchimale-epiteliale (MET) ha dimostrato di svolgere un ruolo importante nella crescita delle cellule tumorali diffuse in siti metastatici^{distanti 28,29}. Un recente studio ha dimostrato che le cellule tumorali del seno derivate dall’EMT possono essere trasifferenti in adipociti, il che potrebbe offrire l’opportunità di inibire la metastasi e superare la resistenza alla terapia nelle cellule tumorali e il cancro ricaduto³⁰. A causa dell’importante ruolo del TGF-β segnalazione nell’attivazione dell’EMT nella carcinogenesi mammario, presentiamo protocolli dettagliati per l’assorbimento occidentale, un saggio di reporter trascrizionale luciferasi, reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR) e immunofluorescenza per lo studio della segnalazione TGF-β, EMT indotto da TGF-β e la trasifferentiazione delle cellule tumorali epiteliali del seno murino derivate dall’EMT in adipociti. Queste tecniche sono gli strumenti analitici più comunemente usati nel campo della biologia cellulare. qRT-PCR viene utilizzato per rilevare, caratterizzare e quantificare i livelli di espressione dell’mRNA in modo quantitativo. Rispetto alla PCR quantitativa (qPCR), una tecnica alternativa, la trascrizione inversa (RT)-PCR può essere utilizzata per determinare l’espressione dell’mRNA in modo semi-quantitativo^31,32. L’assorbimento occidentale viene utilizzato per esaminare specifici livelli proteici in un dato campione di lisato cellulare con vantaggi di sensibilità e specificità, in modo semi-quantitativo. Pertanto, presentiamo un flusso di lavoro sistematico per analizzare i cambiamenti dall’espressione genica all’espressione proteica per aiutare a indagare la segnalazione TGF-β che può essere applicata anche ad altre vie di segnalazione.

Protocol

1. Analisi della fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β utilizzando l’assorbimento occidentale NOTA: Le cellule MCF10A-Ras del seno umano premalignant sono state utilizzate come esempio per indagare le risposte di segnalazione βTGF-β 33. In linea di principio, i metodi descritti di seguito sono applicabili anche ad altre linee cellulari β TGF-β reattive. Coltura della linea cellulare epiteliale del seno MCF10A-Ras a 37 °C nel mezzo dell’Aquila modificato di Dulbecco (DMEM)/F12 contenente L-glutammina con siero di cavallo al 5%, 20 ng/mL fattore di crescita epidermico (EGF), 10 mg/mL di insulina, 100 ng/mL enterotossina colera, 0,5 mg/mL idrocortisone e 1:100 penicillina-streptomicina (Pen-Strep). Tripinare le cellule MCF10A-Ras con 1 mL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 1 minuto e contare le cellule vitali utilizzando un contatore di celle. Cellule di semi in piastre a 6 po ‘ad una densità di 5×105 cellule / pozzo. Dopo la crescita durante la notte, trattare le cellule con TGF-β (5 ng/mL) o tampone di ligando (4 mM HCl, 0,1% di albumina di siero bovino priva di acidi grassi (BSA)) per 1 ora, quindi rimuovere il mezzo di coltura e lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Raffreddare le cellule in piastre a 6 po po’ di ghiaccio e aggiungere 150 μL di tampone di analisi di lysis radio immune preraffreddato (RIPA) (150 mM NaCl, 0,1% Tritone X-100, 0,5% deossicholato di sodio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 e cocktail inibitore della mini proteasi appena aggiunto). Lasciare procedere lalisi sul ghiaccio per 10 minuti. Raschiare le cellule aderenti dal piatto utilizzando un raschietto a celle di plastica, quindi trasferire delicatamente la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo preraffreddato. Centrifugare il lysate cellulare per 10 minuti a 150 forza centrifuga (x g) a 4 °C e trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit di dosaggio proteico compatibile con detergente (DC). Caricare 30 μg di proteine da ciascun campione su un gel di elettroforesi del gel di poliacrilammide di dodecil solfato di sodio al 10% (SDS-PAGE) ed eseguire il gel a una tensione di 100 V per 1,5-2 ore. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di difluoruro di polivinilidene da 45 μm (PVDF) ad una tensione di 110 V per 1-1,5 ore. Trasferire la membrana PVDF in un contenitore appropriato con il lato proteico (il lato che si affacciava sul gel) verso l’alto e sciacquare brevemente la membrana in acqua distillata. Scartare l’acqua, aggiungere la soluzione Ponceau S e mettere la membrana su una piattaforma a dondolo per 1-2 minuti. De-macchiare la membrana con acqua distillata risciacquarla rapidamente e quindi lavarla per 1 minuto. Quindi, metti la membrana PVDF su una scatola di luce e scatta una foto per verificare la parità di carichi totali di proteine. Lavare la membrana con soluzione salina tris-tamponata con Tween 20 (TBST, Tris-HCl da 20 mM, pH 7,4, NaCl da 150 mM e 0,1% di Interpol 20) fino a quando non vi è alcuna colorazione visibile. Mettere la membrana nel tampone di blocco (5% di latte scremato in soluzione TBST) e incubarla per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare la membrana due volte con TBST. Incubare la membrana con anticorpi primari contro il fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, fatto in casa 34),totale SMAD2/3 1:1000 e gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1:1000), durante la notte a 4 °C. Lavare la membrana due volte con TBST e incubare la membrana con un anticorpo secondario contro coniglio o topo (1:5000) per 2 ore. Incubare la membrana PVDF con il substrato ECL occidentale per 30 secondi e rilevare il segnale utilizzando un sistema di imaging. Ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici. 2. Analisi delle risposte trascritte β SMAD3 indotte da TGF Eseguire il test del reporter trascrizionale CAGA12-luciferase dipendente da SMAD3/SMAD4. Coltura e tripsininare le celle MCF10A-Ras come descritto nel passaggio 1. Seminare le cellule in piastre da 24 pozzi a 5×104 cellule / bene e consentire alle cellule di aderire durante la notte. Il giorno dopo la semina, cotrasfezionare le cellule in ogni pozzo con 100 ng del TGF-β/SMAD3-inducibile (CAGA)12 luciferasi trascrizionale reportercostruire 35 e 80 ng del costrutto di espressione β-galattosidasi usando polietilenimina (PEI). La trasfezione β-galattosidasi è usata per normalizzare le differenze nell’efficienza di trasfezione tra diversi pozzi. Impostare ogni gruppo sperimentale in triplice copia. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule affamate con glucosio alto DMEM privo di siero e, 6 ore dopo, aggiungere TGF-β (5 ng / mL) o tampone di ligando (4 mM HCl, 0,1% BSA) come controllo del veicolo alle cellule. Dopo altre 24 ore di incubazione, lavare le cellule due volte con PBS prebellici. Aggiungere 120 μL/ben 1× tampone di lysis e agitare delicatamente la piastra a 4 °C per 20 minuti. Trasferire 30 μL di lisato in ogni pozzo di una micropiatta bianca da 96 pozzi per misurare l’attività della luciferasi usando un luminometro. Trasferire 50 μL di lysate in ogni pozzo di una piastra trasparente da 96 po ‘per misurare l β-galattosidasi. Normalizzare l’attività della luciferasi all’β-galattosidasi e ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici. Analizzare l’espressione dei geni bersaglio β TGF utilizzando la reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR). Coltura e tripsininare le celle MCF10A-Ras come descritto nel passaggio 1. Seminare le cellule in piastre a 6 pozzi a 5×105 cellule / bene e consentire alle cellule di aderire durante la notte. Trattare le cellule con TGF-β (5 ng/mL) o tampone di ligando (4 mM HCl, 0,1% di BSA) per 6 ore, quindi lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS. Isolare l’RNA totale utilizzando un kit di isolamento dell’RNA. Determinare la concentrazione di RNA con un NanoDrop ed eseguire la sintesi di cDNA con 1 μg di RNA utilizzando un primo kit di sintesi cDNA a filo. Utilizzare un sistema di rilevamento PCR in tempo reale per eseguire pcr quantitativi in tempo reale (qRT-PCR) con cDNA diluito dieci volte in una miscela di reazione da 10 μL che include specifici primer umani avanti e indietro per GAPDH (per la normalizzazione), SERPINE1 (codifica per la proteina PAI-1, un gene bersaglio TGF-β/SMAD),SMAD7 (gene bersaglio TGF-β/SMAD) e qPCR Master Mix. Impostare ogni gruppo sperimentale in triplice copia.NOTA: Le sequenze primer utilizzate per rilevare i geni umani bersaglio in qRT-PCR sono elencate nella tabella 1. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione qPCR: inizializzazione, 95 °C per 3 minuti; denaturazione, 95 °C per 10 secondi; ricottura, 60 °C per 30 secondi; e estensione, 80 °C per 10 secondi; denaturazione, ricottura ed estensione vengono ripetuti 40 volte. Ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici. 3. Analisi dell’EMT indotto β TGF Analizzare l’espressione dei marcatori EMT a livello proteico usando western blotting.NOTA: L’analisi dell’EMT indotto β TGF-β viene mostrata utilizzando cellule epiteliali NMuMG del mousecome esempio 36,37. Coltura NMuMG cellule a 37 °C in mezzo di glucosio ad alto DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e 1:100 Pen-Strep. Utilizzare metodi descritti nel passaggio 1 per l’isolamento e il rilevamento delle proteine.NOTA: In questo esperimento vengono utilizzati i seguenti anticorpi: E-cadherina, 1:1000; N-cadherina, 1:1000; Lumaca, 1:1000; Lumaca, 1:1000; Tubulina, 1:1000 (Figura 3). Analizzare l’espressione dei marcatori EMT a livello di mRNA utilizzando quantitative real-time-PCR come descritto nel passaggio 2.2.NOTA: Tutti i primer del mouse utilizzati per qRT-PCR, inclusi CDH1 (codifica della proteina E-cadherina), SNAILe ZEB2 (Figura 3) sono elencati nella tabella 1. Analizzare il processo EMT utilizzando l’immunofluorescenza indiretta e la colorazione a fluorescenza diretta. Colorazione indiretta dell’immunofluorescenza dell’E-cadherina Posizionare sterili coprispatte quadrate laterali da 18 mm in lastre da 6 pozzi (una coverlip per pozzo). Seme 1×105 cellule NMuMG con 2 mL di DMEM completo per piastra a 6 porri e consentire alle cellule di aderire durante la notte. Spostare delicatamente i copripazzi con celle aderenti su una nuova piastra a 6 pozzi e aggiungere 2 mL di mezzo di coltura ai pozzi. Trattare le cellule con TGF-β (5 ng/mL) o tampone ligando (4 mM HCl, 0,1% BSA) per 2 giorni. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di PBS prebellico. Fissare le cellule aggiungendo 1 mL di paraformaldeide al 4% e incubando per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di PBS. Permeabilizzare le celle fisse con lo 0,1% di Tritone X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare le celle due volte con PBS. Bloccare le celle con 5% di BSA in PBS per 1 ora a temperatura ambiente e lavare le celle due volte con PBS. Aggiungere l’anticorpo primario contro l’E-cadherina (diluito 1:1000 in PBS) nella parte superiore di ogni coverlip e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere l’anticorpo primario e lavare il coverslip con PBS tre volte. Aggiungere l’anticorpo secondario Alexa Fluor 555 (diluito 1:500 in PBS) nella parte superiore di ogni coverlip e incubare per 1 ora a temperatura ambiente mentre si copre con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Rimuovere l’anticorpo secondario e lavare il coverslip con PBS tre volte. Montare il coverslip (celle rivolte verso il basso) su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio con 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) e conservare le diapositive montate in una scatola a 4 °C, protetta dalla luce. Osservare la colorazione con microscopia confocale SP8. Colorazione a fluorescenza diretta dell’actina filamentosa (F). Preparare campioni seguendo i passaggi 3.3.1.1. al 3.3.1.9. Macchiare le cellule aggiungendo Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) per 1 ora a temperatura ambiente al buio per visualizzare l’actina filamentosa (F-actin). Lavare le celle tre volte con PBS. Montare il coverslip su vetrini utilizzando un supporto di montaggio con DAPI e scattare immagini con microscopia confocale SP8.

Representative Results

Analisi della segnalazione TGF-βIl passo chiave nella segnalazione TGF-β è la fosforilazione dei due residui di serina terminale più carbossici nel motivo SSXS (Figura 2) di TβRI chinasi38,39. Per indagare sulle risposte di segnalazione β TGF-β, abbiamo eseguito gonfiore occidentale di SMAD2 fosforilato. Nelle cellule MCF10A-Ras del seno umano premalignant, la fosforilazione di SMAD2 è aumentata significativamente in risposta alla stimolazione del TGF-β per 1 ora, mentre l’espressione dell’SMAD2/3 totale non è stata influenzata dal trattamento TGF-β (Figura 4A). Utilizzando il saggio di reporter trascrizionale CAGA-luc indotto da TGF-β/4, abbiamo scoperto che TGF-β ha notevolmente indotto il reporter luciferasi nella linea di cellule MCF10A-Ras rispetto alle cellule non trattate (Figura 4B). Inoltre, abbiamo osservato che obiettivi genico trascrizionale diretti ben caratterizzati di TGF-β tra cui SMAD7 e SERPINE1 (codifica per la proteina PAI-1), erano altamente espressi nelle cellule MCF10A-Ras trattate con TGF-β(Figura 4C). Analisi dell’EMT indotto β TGFLa Corte ha valutato l’EMT indotto da TGF-β con vari metodi, come i cambiamenti morfologici, l’espressione dei marcatori EMT a livello di mRNA e proteine e la colorazione immunofluorescenza dei marcatori EMT36. Le cellule epiteliali NMuMG trattate con TGF-β per 1 e 2 giorni sono cambiate da una morfologia epiteliale classica a una morfologia mesenchimale a forma di mandrino, come mostrato dalla microscopia a contrasto di fase (Figura 5A). Coerentemente con i cambiamenti morfologici, abbiamo osservato che il trattamento TGF-β ha portato ad un aumento dell’espressione proteica dei marcatori mesenchimali, tra cui N-cadherina, Lumaca eLumaca 37 (Figura 5B). Al contrario, l’E-cadherina, un marcatore epiteliale, è stata downregolata nelle cellule NMuMG dopo 2 giorni di trattamento TGF-β(Figura 5B). Inoltre, abbiamo eseguito una reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR) per indagare l’espressione genica dei marcatori EMT. Il CDH1 (codifica per la proteina E-cadherina) è stato significativamente diminuito, mentre marcatori mesenchimali come SNAIL e Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) sono stati notevolmente aumentati dopo la stimolazione TGF-β nelle cellule NMuMG rispetto alle cellule non trattate ( Figura5C). L’EMT indotto β TGF nelle cellule NMuMG è stato ulteriormente confermato dalla colorazione dell’immunofluorescenza dell’E-cadherina. Dopo la stimolazione β TGF per 2 giorni, le cellule NMuMG hanno espresso meno E-cadherina rispetto alle cellule del gruppo di controllo non indotto, come analizzato dalla microscopia confocale (Figura 5D). Inoltre, le cellule NMuMG in presenza di TGF-β formato più fibre di stress da actina, come mostrato dalla microscopia confocale (Figura 5E). SB431542 e GW788388 inibiscono la segnalazione TGF-β e l’EMT indotto β TGFSB431542 è un inibitore competitivo atp del dominio della chinasi del TβRI, mentre la chinasi 5 (ALK5), chiamata anche recettore dell’attivina, mentre GW788388 inibisce l’attività della TβRI e della TβRII chinasi. Entrambi gli inibitori possono inibire la segnalazione del recettore βTGF-β 40. Pertanto, abbiamo trattato cellule NMuMG con diverse concentrazioni di GW788388 in presenza di TGF-β per 1 ora. Come previsto, GW788388 ha inibito la fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β in modo dose-dipendente (Figura 6A). Inoltre, la fosforilazione β TGF-mediata di SMAD2 è stata bloccata dal trattamento SB431542 (Figura 6A). L’SMAD2/3 fosforilato forma un complesso eteromerico con SMAD4 e si trasferisce nel nucleo per modulare la trascrizione dei geni bersaglio. Pertanto, abbiamo studiato la traslocazione di SMAD2/3 nelle cellule NMuMG mediante colorazione ad immunofluorescenza di SMAD2/3. I dati hanno dimostrato che sia SB431542 che GW788388 hanno inibito significativamente la traslocazione nucleare indotta da TGF-β e l’accumulo di SMAD2/3 nelle cellule NMuMG (Figura 6B). Inoltre, gli effetti inibitori di SB431542 e GW788388 sono stati osservati anche nei livelli di espressione dell’mRNA di importanti geni bersaglio TGF-β coinvolti nell’EMT, tra cui PAI-1, LUMACA, E-cadherina e fibronectina (Figura 6C). Questi dati suggerirono che SB431542 e GW788388 bloccarono la segnalazione TGF-β e l’EMT indotto β TGF. Analisi della transdifferenziazione delle cellule del cancro al seno mesenchimale in adipocitiL’EMT svolge un ruolo vitale nel migliorare la plasticità cellulare nei tumori e si traduce nello sviluppo della resistenza alla terapia. La plasticità delle cellule tumorali può essere direttamente mirata e inibita con un approccio di trans-differenziazione, come l’adipogenesiforzata 30. Abbiamo usato cellule tumorali del seno murino Py2T, che derivavano dalla ghiandola mammaria di un topo virus tumorale mammario-polioma medio tumorale-antigene (MMTV-PyMT) transgenico, come modello cellulare di plasticità delle cellule tumorali indotta da EMT. Sulla base di un protocollostabilito 41, abbiamo trattato le cellule tumorali del seno murino Py2T derivate da EMT con il farmaco antidiabetico rosiglitazone per 10 giorni per indurre l’adipogenesi. L’adipogenesi è stata valutata visualizzando le goccioline lipidiche utilizzando la colorazione O rosso olio. Le cellule adipose sono state prontamente rilevate nelle cellule tumorali del seno murino Py2T trattate con rosiglitazone (Figura 7), che hanno dimostrato che il trattamento con rosiglitazone da solo è sufficiente a promuovere la trasifferentiazione delle cellule tumorali del seno derivate dall’EMT in adipociti. Figura 1: Segnalazione TGF-β/SMAD. La segnalazione del TGF-β inizia con il legame del TGF-β al recettore TGF-β di tipo II (TβRII), una chinasi costitutivamente attiva, che fosforilati TGF-β recettore di tipo I (TβRI). Quindi, attivata la TβRI chinasi fosforilati SMAD2/3. Un peptide contenente il motivo SSXS di SMAD2 con due residui di serina fosforilata terminale carbossidica è stato utilizzato per ottenere antisieri policlonali che riconoscono il fosforo-SMAD2 (p-SMAD2). Pertanto, l’analisi dell’espressione p-SMAD2 da parte della macchia occidentale può essere utilizzata per determinare l’attivazione della via di segnalazione TGF-β di segnalazione. L’SMAD2/3 fosforilato può formare complessi eteromerici con SMAD4, che poi si trasferiscono nel nucleo per modulare le risposte trascrittive. Il saggio reporter CAGA12-luciferasi e il PCR quantitativo in tempo reale (qRT-PCR) per l’espressione dell’mRNA dei geni bersaglio TGF-β come SMAD7 e SERPINE1 (codifica della proteina PAI-1), possono essere utilizzati per analizzare le risposte trascritte SMAD3 indotte da TGF-β. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Struttura schematica degli R-SMAD (SMAD2 e SMAD3). I domini MH1 (blu) e MH2 (giallo) sono conservati tra gli R-SMAD, ma l’area del linker (grigio) non è conservata. Il dominio MH1 di SMAD3 ospita un motivo legante il DNA, mentre SMAD2 non può legare direttamente il DNA, a causa di un inserimento (esone 3) nel suo dominio MH1. Il dominio MH2 media l’oligomerizzazione SMAD, l’interazione con i recettori TGF-β e il legame proteico ed è coinvolto nella regolazione trascrizionale. SMAD2 e SMAD3 possono essere attivati dalla fosforilazione del motivo SSXS (in rosso) nei loro termini C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: EMT indotto β TGF. Durante la transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF-β (EMT), le cellule subiscono la perdita epiteliale e l’acquisizione di caratteristiche mesenchimali con una maggiore motilità cellulare e capacità di invasione. L’induzione dell’EMT porta all’espressione di marcatori mesenchimali come N-cadherina, Zeb2 e Lumaca1/2, così come alla downregolazione di marcatori epiteliali tra cui E-cadherina, β-catenina e claudina-1. La perdita o il guadagno accumulato di caratteristiche epiteliali/mesenchimali (E/M) fa sì che una cellula entri negli stati intermedi in modo reversibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Risposte di segnalazione β TGF-β nelle cellule MCF10A-Ras. (A) Le cellule MCF10A-Ras sono state trattate con o senza TGF-β (2,5 ng/mL) per 1 ora e i liti cellulari sono stati immunoblottati per SMAD2 fosforilato (p-SMAD2), SMAD2/3 totale e GAPDH (come controllo del carico). Il marcatore di dimensione è mostrato a destra. Contro: Gruppo di controllo senza TGF-β trattamento. (B) Analisi dell’attività TGF-β (5 ng/mL) utilizzando il reporter trascrizionale CAGA12-luciferasi (LUC) dipendente da SMAD3-SMAD4 nelle cellule MCF10A-Ras. I valori sono normalizzati in β-galattosidasi (βGal). I dati sono espressi come media ± s.d, n = 3. Test t dello studente, ***P ≤ 0.001 (C) qRT-PCR analisi dei geni bersaglio TGF-β SMAD7 e SERPINE1 (codifica per la proteina PAI-1) nelle cellule MCF10A-Ras trattate con TGF-β (2,5 ng/mL) per 6 ore. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I dati sono espressi come media ± s.d, n = 3. Test t dello studente, ***P ≤ 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: EMT indotto β TGF nelle cellule NMuMG. (A) Morfologia delle cellule NMuMG trattate con TGF-β (2,5 ng/mL) per 1 o 2 giorni. In presenza di cellule TGF-β, le cellule NMuMG si sono trasferenziate in un fenotipo mesenchimale. Barra di scala = 150 μm (B) Le cellule NMuMG sono state trattate con o senza TGF-β (5 ng/mL) per 2 giorni, e i marcatori EMT sono stati analizzati dal western blotting. Il marcatore di dimensione è come indicato a destra. Contro: Gruppo di controllo senza TGF-β trattamento. (C) Analisi dell’espressione genica dei marcatori EMT (CDH1 (codifica per la proteina E-cadherina),LUMACA e ZEB2) nelle cellule NMuMG trattate per 2 giorni con TGF-β (5 ng/mL). GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I risultati sono espressi come la media ± s.d., n = 3. Test t dello studente, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) Le cellule NMuMG sono state macchiate dall’immunofluorescenza per rilevare l’espressione del marcatore epiteliale E-cadherina (rosso) dopo il trattamento TGF-β (2,5 ng/mL) per 2 giorni. I nuclei erano controsostenibili con DAPI (blu). Le immagini sono state catturate con microscopia confocale. La barra di scala = 50 μm(E) cellule NMuMG erano macchiate di fluoresceina-phalloidina (verde) per visualizzare f-actina. I nuclei erano controsostenibili con DAPI (blu). Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: TGF-βsignaling e TGF-β-induced EMT sono stati inibiti da SB431542 e GW788388. (A) Le cellule NMuMG sono state trattate con 10 μM di SB431542 (SB) o le concentrazioni indicate di GW788388 (GW) in presenza o assenza di TGF-β (5 ng/mL) per 1 ora. I llysati cellulari sono stati immunoblotted per p-SMAD2, SMAD2/3 e GAPDH. (B) Le cellule NMuMG sono state trattate con 5 μM di SB431542 (SB) o 10 μM di GW788388 (GW) in presenza o assenza di 5 ng/mL di TGF-β per 1 ora e macchiate da immunofluorescenza per rilevare la traslocazione nucleare di SMAD2/3 (verde). Le immagini sono state catturate con microscopia confocale. (C) L’espressione dei geni bersaglio TGF-β, tra cui PAI-1 e i geni che codificano marcatori EMT, tra cui LUMACA, E-Cadherina e Fibronectina, sono stati analizzati mediante reazione a catena della transcriptasi polimerasi inversa (RT-PCR) nelle cellule NMuMG dopo il trattamento SB o GW e stimolazione TGF-β per 48 ore. GAPDH fungeva da controllo di carico. Il controllo indica le celle non trattate. Questa cifra è stata modificata da Petersen M. et al. 34 con il permesso dell’editore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Le cellule tumorali del seno murino Py2T derivate dall’EMT possono essere indotte a differenziarsi in adipociti. Le cellule tumorali del seno murino Py2T sono state stimolate con 2 ng/ mL TGF-β per 20 giorni per indurre l’EMT completo. Quindi, le cellule sono state trattate con DMSO come controllo del veicolo o rosiglitazone (2 μM) per 10 giorni per consentire la differenziazione delle cellule tumorali mesenchimali e indurre l’adipogenesi. Il mezzo è stato cambiato ogni 2 giorni. Dopo 10 giorni di trattamento, le cellule sono state macchiate con olio rosso O. Barra scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. specie Nome genico Avanti (da 5′ a 3′) Rovescio (da 5′ a 3′) Umano GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG SMAD7 TCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG SERPINA1 CACAAATCAGACGGCAGCACT CATCGGGCGTGGTGAACTC topo GAPDH TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC AAGATGGTGATGGGCTTCCCG Cdh1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG lumaca CAGCTGGCCAGGCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA ZEB2 TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCAT Tabella 1: Primer utilizzati per qRT-PCR.

Discussion

La segnalazione TGF-β/SMAD svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro al seno, in quanto può promuovere l’invasività e la metastasi delle cellule tumorali del seno inducendo EMT⁷. Qui, abbiamo descritto un flusso di lavoro logico per indagare la segnalazione avviata da TGF-β dall’attivazione SMAD indotta dal recettore alle risposte trascrizionale e biologiche mediate da SMAD. Abbiamo iniziato descrivendo l’analisi della fosforilazione SMAD2, proseguita con le risposte trascrittive dipendenti da SMAD3 indotte da TGF-β e l’espressione marcatore EMT sia a livello genico che proteico per analizzare la risposta di segnalazione TGF-β/SMAD, e infine abbiamo esaminato l’EMT indotta da TGF-β. Abbiamo utilizzato il reporter trascrizionale CAGA₁₂-luciferase contenente scatole CAGA derivate dal promotore PAI-1, per monitorare l’attività della via di segnalazione TGF-β/SMAD³⁵. Questo costrutto reporter richiede SMAD3 e SMAD4 per l’attivazione. Studi precedenti hanno dimostrato che il knockdown di SMAD4 attenuato TGF-β indotto CAGA₁₂-luciferasi^{attività 37}. Oltre al saggio del reporter, determinare lo stato di fosforilazione degli SMAD endogeni, tra cui SMAD2 e SMAD3, è un altro modo per indagare la risposta di segnalazione del TGF-β. Infatti, anche altri membri della famiglia TGF-β, come il fattore di crescita e differenziazione (GDF)-8/miostatina e GDF-9, trasducono segnali tramite proteine SMAD2/3 impegnando TβRI^42,43,44. Oltre al reporter CAGA₁₂-luciferase, diversi reporter simili sono stati utilizzati per rilevare l’attivazione del TGF-β segnalazione. Ad esempio, un reporter trascrizionale (SBE)₄-Lux con elementi di risposta derivati dal promotore JunB può essere indotto in modo efficiente da TGF-β, attivatine e BMP⁴⁵.

L’blotting occidentale e il qPCR sono stati usati per analizzare l’EMT indotto da TGF-β, che sono metodi classici per indagare l’espressione di marcatori epiteliali (cioè E-cadherina) e marcatori mesenchimali (cioè N-cadherina, Lumaca, Lumaca e Zeb2). Abbiamo anche eseguito la colorazione indiretta dell’immunofluorescenza dell’E-cadherina e la colorazione a fluorescenza diretta dell’F-actina. Questi test hanno ulteriormente convalidato il fenotipo mesenchimale delle cellule dopo il trattamento con β TGF. La limitazione della colorazione dell’immunofluorescenza è che le cellule devono essere fissate prima dell’incubazione con anticorpi e imaging, ed è difficile indagare i cambiamenti nell’espressione del marcatore EMT nelle cellule vive. Recentemente, il design delle linee cellulari reporter EMT, come l’adenocarcinoma polmonare A549-vimentina-RFP, ha permesso di monitorare la trasformazione delle cellule epiteliali in cellule mesenchimali in tempo reale attraverso l’espressione di vimentina taggata da proteine fluorescenti rosse (RFP). Questa piattaforma potrebbe essere utilizzata per lo screening dei farmaci e lo sviluppo di nuovi^{farmaci 46}. Il colorante LifeAct, un peptide 17-amminoacido, in grado di macchiare le strutture F-actina nelle cellule viventi, sta diventando uno strumento prezioso per visualizzare l’actina citoscheletro in tempo reale senza interferire con i processi cellulari⁴⁷. In questo studio, abbiamo usato due inibitori a piccole molecole, SB431542 e GW788388, per convalidare il loro effetto inibitorio sulla segnalazione TGF-β e sull’EMT indotto da TGF-β. In particolare, GW788388 inibisce potentemente l’attività di TβRI e TβRII, mentre SB431542 ha un effetto inibitorio solo su TβRI (e ALK4 e ALK7). Studi precedenti hanno rivelato che GW788388 è più potente in vivo di SB431542⁴⁰. Oltre all’inibizione dell’EMT, GW788388 ha ridotto l’espressione dei marcatori di fibrosi nel rene e la somministrazione orale di GW788388 nei topi diabetici ha notevolmente diminuito la glomerulopatia^25,48.

L’EMT svolge un ruolo essenziale nella promozione della plasticità delle cellule tumorali e si traduce nella resistenza ai farmaci e nella ^{metastasi 49}. Pertanto, il targeting di cellule derivate dall’EMT con specifici farmaci citotossici⁵⁰ o l’indurzione della ridifferenziazione tramite transizione mesenchimale-epiteliale (MET)^{51 è} stato proposto come approccio per superare la metastasi delle cellule tumorali e la resistenza alla terapia. Tuttavia, il MET contribuisce alla proliferazione delle cellule tumorali diffuse negli organi^{distanti 52}, che potrebbero essere controproducenti quando si utilizza la reversione terapeutica dell’EMT. Recentemente, un nuovo studio ha riportato un approccio terapeutico di transdifferenziazione prendendo di mira direttamente le cellule tumorali del seno derivate dall’EMT per la differenziazione in adipociti³⁰. Lo studio di Ishay-Ronen et. al.^{30 ha} usato cellule tumorali epiteliali murine Py2T che avevano subito una transizione verso cellule mesenchimali in risposta al trattamento a lungo termine con TGF-β. Hanno dimostrato che la rosiglitazone in combinazione con gli inibitori del MEK ha migliorato la differenziazione epiteliale e l’adipogenesi. Tuttavia, abbiamo scoperto che rosiglitazone da solo era sufficiente per indurre la trasifferentiazione delle cellule murine Py2T mesenchimali in adipociti.

In sintesi, i metodi utilizzati in questo studio hanno fornito un flusso di lavoro logico per indagare la segnalazione di TGF-β e l’EMT indotto β TGF-β. I due inibitori, SB431542 e GW788388, possono bloccare le risposte indotte β TGF e l’EMT. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che rosiglitazone da solo induce adipogenesi in alcune cellule tumorali mammari mesenchimali indotte da TGF-β indotti. Sebbene abbiamo usato solo diverse linee cellulari per il cancro al seno per indagare le risposte del TGF-β, i metodi qui descritti potrebbero essere estrapolati ad altre cellule (tumorali). Qui, abbiamo usato varie concentrazioni di TGF-β per indurre risposte cellulari. Nella maggior parte dei tipi di cellule, il TGF-β esercita la sua attività biologica nell’intervallo di concentrazione di 0,01-10 ng/mL⁵³ e induce la segnalazione in un modello dose-risposta. Nelle cellule endoteliali primarie, comprese le cellule endoteliali aortiche bovine, il TGF-β ha indotto la sostanziale espressione di SMAD2 fosforilato a 0,025 ng/mL, ha raggiunto un massimo di 0,25 ng/mL ed è rimasto a questo livello in risposta a^{concentrazioni più elevate 53}. Nel nostro studio, abbiamo usato un’alta concentrazione di TGF-β (5 ng / mL) nelle cellule MCF10A-Ras per il saggio del reporter trascrizionale per ottenere risposte forti. La fosforilazione SMAD2 e l’espressione genica bersaglio possono essere indotte da TGF-β a bassa dose; pertanto, abbiamo usato 2,5 ng/mL TGF-β per trattare le cellule. Tuttavia, la concentrazione di lavoro più adatta dipende dal tipo di cella e dagli effetti stimati. Per determinare la migliore concentrazione di TGF-β, si consiglia di trattare le cellule con dosi diverse (da basse a alte).

Materials

Reagent
18 mm-side square glass coverslips	Menzel Gläser	631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21422
Anti-E-cadherin antibody	BD Biosciences	610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody	Merck Millipore	MAB374
Anti-N-cadherin antibody	BD Biosciences	610920
Anti-Slug antibody	Cell Signaling Technology	9585
anti-SMAD2/3 antibody	Becton Dickinson	610842
Anti-Snail antibody	Cell Signaling Technology	3879
Anti-Tubulin antibody	Cell Signaling Technology	2148
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Cholera enterotoxin	Sigma-Aldrich	C8052
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705060
DC protein assay kit	Bio-Rad	5000111
DMEM-high glucose	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM-high glucose medium	Thermo Fisher Scientific	11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12	Thermo Fisher Scientific	11039047
epidermal growth factor (EGF)	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum (FBS)	BioWest	S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix	PROMEGA	A600X
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	26050088
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
NucleoSpin RNA II kit	BIOKE´	740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Thermo Fisher Scientific	15140148
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck Millipore	IPVH00010
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	K1621
Skimmed milk	Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001402
CFX Connect Detection System	Bio-Rad	1855201
Luminometer	Perkin Elmer	2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND-2000