Vi beskriver en systematisk arbeidsflyt for å undersøke TGF-β signalisering og TGF-β-indusert EMT ved å studere protein og genuttrykk involvert i denne signalveien. Metodene inkluderer vestlig blotting, en luciferase reporter analyse, qPCR, og immunofluorescence flekker.
Transforming vekstfaktor-β (TGF-β) er en utskillelig multifunksjonell faktor som spiller en nøkkelrolle i intercellulær kommunikasjon. Perturbasjoner av TGF-β signalisering kan føre til brystkreft. TGF-β fremkaller dens effekter på spredning og differensiering via spesifikk celleoverflate TGF-β type I og type II reseptorer (det vil si TβRI og TβRII) som inneholder en egen serine/threonine kinase domene. Ved TGF-β-indusert heteromerisk kompleks formasjon, aktivert TβRI fremkaller intracellulær signalisering ved fosforylering SMAD2 og SMAD3. Disse aktiverte SMADs danner heteromeriske komplekser med SMAD4 for å regulere spesifikke målgener, inkludert plasminogenaktiveringshemmer 1 (PAI-1, kodet av SERPINE1-genet). Induksjonen av epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) tillater epitelkreftceller på det primære stedet eller under kolonisering på fjerne steder for å få en invasiv fenotype og drive tumorprogresjon. TGF-β fungerer som en potent induktor av brystkreft invasjon ved å kjøre EMT. Her beskriver vi systematiske metoder for å undersøke TGF-β signal- og EMT-responser ved hjelp av premalignant humane MCF10A-RAS (M2) celler og mus NMuMG epitelceller som eksempler. Vi beskriver metoder for å bestemme TGF-β-indusert SMAD2 fosforylering ved vestlig blotting, SMAD3/SMAD4-avhengig transkripsjonsaktivitet ved hjelp av luciferase reporteraktivitet og SERPINE1-målgenuttrykk ved kvantitativ sanntidspolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR). I tillegg er metoder beskrevet for å undersøke TGF-β-indusert EMT ved å måle endringer i morfologi, epitel- og mesenchymal markøruttrykk, filamentøs aktinfarging og immunofluorescence farging av E-kaderin. To selektive små molekyl TGF-β reseptor kinase hemmere, GW788388 og SB431542, ble brukt til å blokkere TGF-β-indusert SMAD2 fosforylering, mål gener og endringer i EMT markør uttrykk. Videre beskriver vi transdifferentiation av mesenchymal bryst Py2T murine epiteltumceller i adipocytter. Metoder for å undersøke TGF-β-indusert signalering og EMT i brystkreft kan bidra til nye terapeutiske tilnærminger for brystkreft.
Cytokin transformere vekstfaktor-β (TGF-β) er prototypen av en stor gruppe strukturelt og funksjonelt relaterte regulatoriske polypeptider inkludert TGF-βs (det vil si TGF-β1, -β2 og -β3), bein morfogene proteiner (BMPs) ogaktiviner 1,2. Disse cytokinene spiller alle viktige roller i embryonisk utvikling og i å opprettholde vev og organ homeostase3. Feilreguleringen av TGF-β kan føre til et stort utvalg av sykdommer, inkludert kreft4,5. TGF-β spiller en kompleks, dobbel rolle i kreftprogresjon: i normale og premalignant epitelceller oppfører TGF-β seg som en tumorsuppressor ved å hemme spredning og indusere apoptose6,7; men på slutten av tumorprogresjonen, når cytostatiske responser er blokkert ved aktivering av onkogener eller tap av tumorsuppressorgener, fungerer TGF-β som en tumorforsterker ved å fremme epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i kreftceller, og dermed muliggjør kreftcelleinvasjon og metastase, som virker på celler i tumormikromiljøet og stimulerende angiogenese og immununndragelse8,9,10.
TGF-β utskilles som et inaktivt forløpermolekyl som inneholder den modne karboksy-terminal TGF-β og latens-assosiert peptid (LAP)11. Dette lille komplekset kan være kovalent bundet av latent TGF-β-bindende protein (LTBP)12. Utgivelsen av modne TGF-β kan medieres ved virkningen av spesifikke proteaser som cleave LAP eller ved mekanisk trekking av LAP i en integrin-avhengig prosess13,14. I tillegg til LTBP, Glycoprotein En repetisjoner dominerende (GARP) er høyt uttrykt på overflaten av regulatoriske T-celler (Tregs) og spiller en lignende rolle som LTBP i å regulere aktiveringen av TGF-β15,16. GARP binder seg direkte til latent TGF-β gjennom disulfid kobling og ikke-kovalent forening. Aktiveringen av TGF-β fra GARP/TGF-β-komplekset krever integrins17. Modne TGF-β binder seg til TGF-β serine/threonine kinase reseptorer, det vil si TGF-β type I (TβRI) og TGF-β type II (TβRII)reseptorer 18 å starte signalering. Bindingen av TGF-β til TβRII fremmer rekruttering av TβRI og dannelsen av et heteromerisk kompleks. Deretter er TβRI fosforylert av TβRII kinase på serin og sparoninrester i et kort glysin- og serinrikt (GS) motiv, noe som resulterer i aktivering19,20. Ved aktivering rekrutterer og fosforyler sine substrater: de to reseptorspesifikke SMADene (R-SMADs) som inkluderer SMAD2 og SMAD3 (figur 1). R-SMADs deler en lignende total struktur med to såkalte Mad homology domener, MH1 og MH2, som er atskilt med en proline-rik linker region (Figur 2). DNA-bindingsmotivet i MH1-domenet SMAD3 er ikke bevart mellom SMAD2 og SMAD3, og SMAD2 kan ikke binde DNA direkte på grunn av to innsettinger i MH1-domenet (exon 3 og L1). SMAD2 og SMAD3 kan aktiveres ved fosforylering av SSXS-motivet i deres C-termini (figur 2). Fosforylert SMAD2/3 danner heteromeriske komplekser med en vanlig SMAD-mekler, SMAD4, som translocates inn i kjernen for å modulere transkripsjonen av målgener (figur 1)7,21. Denne kanoniske SMAD signalveien er nettopp regulert og genererer spesifikke cellulære og vevsresponser som regulering av celleskjebne og tumorcellemetastase og invasjon22. I tillegg til TGF-β-SMAD-signalering, kan ikke-SMAD-signalveier også aktiveres direkte av reseptorer for å regulere nedstrøms cellulæreresponser 23.
Under tumorprogresjon er aktiveringen av TGF-β-induserte SMAD-avhengige og SMAD-uavhengige veier nødvendig for induksjon av EMT. EMT er en reversibel prosess der tumorceller dedifferentiate fra en epitelfenotype, som er forbundet med tap av cellecellekontakter og redusert apical-basal polaritet, til en mesenchymal fenotype med forbedret motilitet og invasjonsevne24. EMT er preget av økt uttrykk for mesenchymale markørproteiner, inkludert N-kadherin, vimentin, Zeb2 og Snail1/2, og samtidig nedregulering av epitelmarkører, som E-kadherin og β-catenin (figur 3)25. Overgangen fra en epitel til en mesenchymal tilstand er imidlertid ofte ufullstendig, og celler får blandede epitel- og mesenchymale (E/M) egenskaper. En fersk artikkel fra International EMT association proposed to describe the process of cells undergoing intermediate E/M fenotypic states as epitel-mesenchymal plasticity (EMP)26. Denne plastisiteten refererer til delvis EMT, en hybrid E/M-status, en metastable EMT-tilstand, et EMT-kontinuum og etEMT-spektrum 26. Under EMT får tumorceller kreftstamcelleegenskaper (CSC) og blir mer motstandsdyktige mot løsrivelsesindusert apoptose27. Mens EMT er ansvarlig for oppkjøpet av en invasiv fenotype i primære tumorceller og driver kreftprogresjon, har mesenchymal-epitelovergang (MET) vist seg å spille en viktig rolle i utveksten av spredte tumorceller på fjerne metastatiskesteder 28,29. En fersk studie viste at EMT-avledede brystkreftceller kan transdifferentiated i adipocytter, som kan gi en mulighet til å hemme metastase og overvinne terapi motstand i tumorceller og tilbakefall kreft30. På grunn av den viktige rollen TGF-β signalisering i aktivering av EMT i brystkarsinogenese, vi presenterer detaljerte protokoller for vestlig blotting, en luciferase transkripsjonsreporter analyse, kvantitativ sanntid-polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR), og immunofluorescens for undersøkelse av TGF-β signalering, TGF-β-indusert EMT, og transdifferentiation av EMT-avledede murine bryst epiteltumtumceller i adipocytter. Disse teknikkene er de mest brukte analytiske verktøyene i cellebiologifeltet. qRT-PCR brukes til å oppdage, karakterisere og kvantifisere mRNA-uttrykksnivåer på en kvantitativ måte. Sammenlignet med kvantitativ PCR (qPCR), en alternativ teknikk, kan omvendt transkripsjon (RT)-PCR brukes til å bestemme mRNA-uttrykk på en semi-kvantitativmåte 31,32. Vestlig blotting brukes til å undersøke spesifikke proteinnivåer i en gitt cellelylatprøve med fordeler av følsomhet og spesifisitet, på en semi-kvantitativ måte. Dermed presenterer vi en systematisk arbeidsflyt for å analysere endringer fra genuttrykk til proteinuttrykk for å undersøke TGF-β-signalering som også kan brukes på andre signalveier.
TGF-β/SMAD-signalering spiller en avgjørende rolle i brystkreftprogresjon, da det kan fremme brystkreftcelleinvasivitet og metastase ved å indusere EMT7. Her beskrev vi en logisk arbeidsflyt for å undersøke TGF-β-initiert signalisering fra reseptorindusert SMAD-aktivering til SMAD-medierte transkripsjons- og biologiske responser. Vi startet med å beskrive analysen av SMAD2 fosforylering, fortsatte med TGF-β-indusert SMAD3-avhengige transkripsjonsresponser og EMT-markøruttrykk på både gen- og proteinnivåene for å analysere TGF-β/SMAD-signalresponsen, og til slutt undersøkte TGF-β-indusert EMT. Vi brukte CAGA12-luciferase transkripsjonsreporter som inneholder CAGA-bokser avledet fra PAI-1-arrangøren, til å overvåke aktiviteten til TGF-β/ SMAD-signalveien35. Denne reporterkonstruksjonen krever SMAD3 og SMAD4 for aktivering. Tidligere studier har vist at knockdown av SMAD4 dempet TGF-β-indusert CAGA12-luciferase aktivitet37. I tillegg til reporteranalysen, bestemme fosforylering status for endogene SMADs, inkludert SMAD2 og SMAD3, er en annen måte å undersøke TGF-β signalrespons. Faktisk, andre medlemmer av TGF-β familien, som vekst og differensiering faktor (GDF)-8/myostatin og GDF-9, også transdusere signaler via SMAD2/3 proteiner ved å engasjere TβRI42,43,44. I tillegg til CAGA12-luciferase reporter, flere lignende journalister har blitt brukt til å oppdage aktivering av TGF-β signalisering. For eksempel kan en transkripsjons (SBE)4-Lux-reporter med svarelementer avledet fra JunB-arrangøren effektivt induseres av TGF-β, activins og BMPs45.
Vestlig blotting og qPCR ble brukt til å analysere TGF-β-indusert EMT, som er klassiske metoder for å undersøke uttrykket av epitelmarkører (det vil si E-kadherin) og mesenchymale markører (det vil si N-kadherin, Snail, Slug og Zeb2). Vi utførte også indirekte immunofluorescensfarging av E-kaderin og direkte fluorescensfarging av F-actin. Disse analysene validerte videre mesenchymal fenotype av celler etter TGF-β behandling. Begrensningen av immunofluorescence farging er at cellene må fikses før inkubasjon med antistoffer og bildebehandling, og det er vanskelig å undersøke endringer i EMT markør uttrykk i levende celler. Nylig har utformingen av EMT reporter cellelinjer, for eksempel A549 lunge adenokarsinom-vimentin-RFP, gjort det mulig å overvåke transformasjonen av epitelceller til mesenchymale celler i sanntid via uttrykk for rødt fluorescerende protein (RFP)-merket vimentin. Denne plattformen kan benyttes til narkotikascreening og ny narkotikautvikling46. LifeAct fargestoff, en 17-amino-syre peptid, som kan flekke F-actin strukturer i levende celler, blir et verdifullt verktøy for å visualisere actin cytoskeleton i sanntid uten å forstyrre cellulæreprosesser 47. I denne studien brukte vi to småmolekylhemmere, SB431542 og GW788388, for å validere deres hemmende effekt på TGF-β-signalering og TGF-β-indusert EMT. Spesielt, GW788388 sterkt hemmer TβRI og TβRII aktivitet, mens SB431542 har en hemmende effekt på bare TβRI (og ALK4 og ALK7). Tidligere studier viste at GW788388 er mer potent in vivo enn SB43154240. I tillegg til hemming av EMT reduserte GW788388 uttrykket for fibrosemarkører i nyrene, og oral administrering av GW788388 hos diabetiske mus reduserte markert glomerulopati25,48.
EMT spiller en viktig rolle i å fremme kreftcelleplastisitet og resulterer i legemiddelresistens og metastase 49. Derfor, rettet mot EMT-avledede celler med spesifikke cytotoksiskelegemidler 50 eller induserer redifferentiation via mesenchymal-til-epitelovergang (MET)51 har blitt foreslått som en tilnærming til å overvinne kreftcellemetastase og behandlingsresistens. MET bidrar imidlertid til spredning av spredte kreftceller i fjerne organer52, som kan være kontraproduktiv når du bruker terapeutisk reversjon av EMT. Nylig rapporterte en ny studie en terapeutisk transdifferentiation tilnærming ved direkte målretting EMT-avledede brystkreftceller for differensiering i adipocytter30. Studien av Ishay-Ronen et. al.30 brukte Py2T murine epitelkreftceller som hadde gjennomgått en overgang til mesenchymale celler som svar på langvarig behandling med TGF-β. De viste at rosiglitazon i kombinasjon med MEK-hemmere forbedret epiteldilatering og adipogenese. Vi fant imidlertid at rosiglitazon alene var tilstrekkelig til å indusere transdifferentiation av mesenchymal Py2T murine celler i adipocytter.
Oppsummert ga metodene som brukes i denne studien en logisk arbeidsflyt for å undersøke TGF-β-signalering og TGF-β-indusert EMT. De to hemmerne, SB431542 og GW788388, kan blokkere TGF-β-induserte responser og EMT. I tillegg viste vi også rosiglitazon alene induserer adipogenese i visse TGF-β-induserte mesenchymale brystkreftceller. Selv om vi brukte bare flere brystkreftcellelinjer for å undersøke TGF-β svar, metodene beskrevet her kan ekstrapoleres til andre (kreft) celler. Her brukte vi ulike TGF-β konsentrasjoner for å indusere cellulære responser. I de fleste celletyper utøver TGF-β sin biologiske aktivitet i konsentrasjonsområdet 0,01-10 ng/ml53 og induserer signalering i et doseresponsmønster. I primære endotelceller, inkludert storfe aorta endotelceller, TGF-β indusert det betydelige uttrykket av fosforylert SMAD2 på 0,025 ng / ml, nådde maksimalt på 0,25 ng / ml, og forble på dette nivået som svarpå høyere konsentrasjoner 53. I vår studie brukte vi en høy konsentrasjon av TGF-β (5 ng/ml) i MCF10A-Ras-celler for transkripsjonsreporteranalysen for å oppnå sterke svar. SMAD2 fosforylering og målgenuttrykk kan induseres av TGF-β ved en lav dose; Dermed brukte vi 2,5 ng/ml TGF-β til å behandle celler. Imidlertid avhenger den mest passende arbeidskonsentrasjonen av celletypen og estimerte effekter. For å bestemme den beste konsentrasjonen av TGF-β, behandle cellene med forskjellige doser (fra lav til høy) anbefales.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner støtte fra det kinesiske stipendrådet (CSC) til J.Z. og Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) til P.t.D.
Reagent | |||
18 mm-side square glass coverslips | Menzel Gläser | 631-1331 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Alexa Fluor 555 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21422 | |
Anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | |
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody | Merck Millipore | MAB374 | |
Anti-N-cadherin antibody | BD Biosciences | 610920 | |
Anti-Slug antibody | Cell Signaling Technology | 9585 | |
anti-SMAD2/3 antibody | Becton Dickinson | 610842 | |
Anti-Snail antibody | Cell Signaling Technology | 3879 | |
Anti-Tubulin antibody | Cell Signaling Technology | 2148 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Cholera enterotoxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705060 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
DMEM-high glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
DMEM-high glucose medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11039047 | |
epidermal growth factor (EGF) | Merck Millipore | 01-107 | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWest | S1860-500 | |
GoTaq qPCR Master Mix | PROMEGA | A600X | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 26050088 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
NucleoSpin RNA II kit | BIOKE´ | 740955 | |
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Skimmed milk | Campina: Elk | ||
Equipment | |||
ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001402 | |
CFX Connect Detection System | Bio-Rad | 1855201 | |
Luminometer | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 |