Vi beskriver ett systematiskt arbetsflöde för att undersöka TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT genom att studera protein och gen uttryck som är involverade i denna signalering utbildningsavsnitt. Metoderna inkluderar western blotting, en luciferase reporter analys, qPCR och immunofluorescens färgning.
Omvandla tillväxtfaktor-β (TGF-β) är en utsöndrad multifunktionell faktor som spelar en nyckelroll i intercellulär kommunikation. Perturbations av TGF-β signalering kan leda till bröstcancer. TGF-β framkallar dess effekter på spridning och differentiering via specifika cellytan TGF-β typ I- och typ II-receptorer (dvs. TβRI och TβRII) som innehåller en inneboende serin/treoninkinasdomän. Vid TGF-β-inducerad heteromeric komplexa bildandet, aktiverade TβRI framkallar intracellulära signalering genom fosforylerande SMAD2 och SMAD3. Dessa aktiverade SMADs bildar heteromeriska komplex med SMAD4 för att reglera specifika målgener, inklusive plasminogenaktiveringshämmare 1 (PAI-1, kodad av SERPINE1-genen). Induktion av epitelial-till-mesenchymal övergång (EMT) tillåter epitelial cancerceller på den primära platsen eller under kolonisering på avlägsna platser att få en invasiv fenotyp och driva tumörprogression. TGF-β fungerar som en potent inducerare av bröstcancer invasion genom att driva EMT. Här beskriver vi systematiska metoder för att undersöka TGF-β signalering och EMT svar med premalignant mänskliga MCF10A-RAS (M2) celler och mus NMuMG epitelceller som exempel. Vi beskriver metoder för att bestämma TGF-β-inducerad SMAD2 fosforylering av västra blotting, SMAD3/SMAD4-beroende transkriptionell verksamhet med luciferase reporter verksamhet och SERPINE1 mål gen uttryck genom kvantitativ realtid-polymeras kedjereaktion (qRT-PCR). Dessutom beskrivs metoder för att undersöka TGF-β-inducerad EMT genom att mäta förändringar i morfologi, epitelial och mesenchymal markör uttryck, filamentous aktin färgning och immunofluorescens färgning av E-cadherin. Två selektiva små molekyl TGF-β receptorkinashämmare, GW788388 och SB431542, användes för att blockera TGF-β-inducerad SMAD2 fosforylering, mål gener och förändringar i EMT markör uttryck. Dessutom beskriver vi transdifferentiering av mesenchymala bröst Py2T murin epitelial tumör celler i adipocytes. Metoder för att undersöka TGF-β-inducerad signalering och EMT i bröstcancer kan bidra till nya terapeutiska metoder för bröstcancer.
Cytokinen som omvandlar tillväxtfaktor β (TGF-β) är prototypen av en stor grupp strukturellt och funktionellt relaterade regulatoriska polypeptider inklusive TGF-βs (dvs. TGF-β1, -β2 och -β3), benmorfogena proteiner (BMPs) och aktiviner1,2. Dessa cytokiner spelar alla viktiga roller i embryonal utveckling och för att upprätthålla vävnad och organhomeostas3. Felregleringen av TGF-β leda till ett stort antal sjukdomar, inklusive cancer4,5. TGF-β spelar en komplex, dubbel roll i cancerprogression: i normala och premalignant epitelceller beter sig TGF-β som en tumördämpare genom att hämma spridningen och inducera apoptos6,7; i det sena skedet av tumörprogressionen när cytostatika svar blockeras av aktivering av oncogenes eller förlust av tumör suppressor gener, TGF-β fungerar som en tumör förstärkare genom att främja epitelial-till-mesenchymal övergång (EMT) i cancerceller, vilket möjliggör cancer cell invasion och metastasering, verkar på celler i tumör microenvironment, och stimulera angiogenes och immunundvikande 8,9,10.
TGF-β utsöndras som en inaktiv prekursormolekyl som innehåller den mogna karboxyterminalen TGF-β och latens-associerade peptiden (LAP)11. Detta lilla komplex kan kovaly bindas av latent TGF-β-bindande protein (LTBP)12. Frisättningen av mogna TGF-β kan förmedlas genom verkan av specifika proteaser som klyver LAP eller genom mekanisk dragning av LAP i en integrinberoende process13,14. Förutom LTBP, Glykoprotein En upprepning dominerande (GARP) uttrycks högt på ytan av reglerande T-celler (Tregs) och spelar en liknande roll som LTBP i regleringen av aktiveringen av TGF-β15,16. GARP binder direkt till latent TGF-β genom disulfidlänkage och icke-covalent associering. Aktiveringen av TGF-β garp/TGF-β kräver integrins17. Mogna TGF-β binder till TGF-β serin/treoninkinasreceptorer, dvs. TGF-β typ I (TβRI) och TGF-β typ II(TβRII) receptorer18 för att initiera signalering. Bindningen av TGF-β till TβRII främjar rekryteringen av TβRI och bildandet av ett heteromeriskt komplex. Därefter fosforyleras TβRIRI med TβRII-kinaser på serin- och treoninrester i ett kort glytin- och serinrikt (GS) motiv, vilket resulterar i aktivering19,20. Vid aktivering rekryterar och fosforylerar aktiverade TβRI sina substrat: de två receptorspecifika SMADs (R-SMADs) som inkluderar SMAD2 och SMAD3 (Figur 1). R-SMADs delar en liknande övergripande struktur med två så kallade Mad homology-domäner, MH1 och MH2, som separeras av en proline-rik linkerregion (Figur 2). DNA-bindningsmotivet inom MH1-domänen SMAD3 bevaras inte mellan SMAD2 och SMAD3, och SMAD2 kan inte direkt binda DNA på grund av två infogningar i sin MH1-domän (exon 3 och L1). SMAD2 och SMAD3 kan aktiveras genom fosforylering av SSXS-motivet i deras C-termini (figur 2). Fosforylerad SMAD2/3 bildar heteromeriska komplex med en gemensam SMAD-medlare, SMAD4, som flyttar in i kärnan för att modulera transkriptionen av målgener (figur 1)7,21. Denna kanoniska SMAD-signalväg är exakt reglerad och genererar specifika cellulära och vävnadssvar som reglering av cellens öde och tumörcellsmetastas och invasion22. Förutom TGF-β-SMAD-signalering kan icke-SMAD-signalvägar också aktiveras direkt av receptorer för att reglera nedströms cellulärasvar 23.
Under tumör progression, aktivering av TGF-β-inducerad SMAD-beroende och SMAD-oberoende vägar behövs för induktion av EMT. EMT är en reversibel process där tumörceller dedifferentierar sig från en epitelial fenotyp, vilket är förknippat med förlust av cellcellskontakter och minskad apical-basal polaritet, till en mesenchymal fenotyp med förbättrad motilitet och invasionsförmåga24. EMT kännetecknas av ökat uttryck av mesenkymala markörproteiner, inklusive N-cadherin, vimentin, Zeb2 och Snail1/2, och samtidig nedreglering av epitelmarkörer, såsom E-cadherin och β-catenin (Figur 3)25. Övergången från ett epitelial till ett mesenchymalt tillstånd är dock ofta ofullständig, och celler får blandade epitelial och mesenchymala (E/M) egenskaper. Ett nytt dokument av International EMT association föreslog att beskriva processen med celler som genomgår mellanliggande E/M fenotypiska tillstånd som epitelial-mesenchymal plasticitet (EMP)26. Denna plasticitet avser partiell EMT, en hybrid E/M-status, ett metastabilt EMT-tillstånd, ett EMT-kontinuum och ett EMT-spektrum26. Under EMT får tumörceller cancerstamcellsegenskaper (CSC) och blir mer resistenta mot lösgöring-inducerad apoptos27. Medan EMT är ansvarig för förvärvet av en invasiv fenotyp i primära tumörceller och driver cancerprogression, däremot, mesenchymal-epitelial övergång (MET) har visat sig spela en viktig roll i utväxten av spridas tumörceller på avlägsna ögonbevarande platser28,29. En ny studie visade att EMT-härledda bröstcancerceller kan transdifferentieras till adipocyter, vilket kan erbjuda en möjlighet att hämma metastasering och övervinna behandlingsresistens i tumörceller och återfallscancer30. På grund av den viktiga rollen av TGF-β signalering i aktiveringen av EMT i bröst carcinogenes, Vi presenterar detaljerade protokoll för västra blotting, en luciferase transcriptional reporter analys, kvantitativ realtid-polymeras kedjereaktion (qRT-PCR) och immunofluorescens för undersökning av TGF-β signalering, TGF-β-inducerad EMT och transdifferentiering av EMT-härledda murin bröst epitelial tumör i adipocytes. Dessa tekniker är de vanligaste analysverktygen inom cellbiologiområdet. qRT-PCR används för att upptäcka, karakterisera och kvantifiera mRNA-uttrycksnivåer på ett kvantitativt sätt. Jämfört med kvantitativ PCR (qPCR), en alternativ teknik, kan omvänd transkription (RT)-PCR användas för att bestämma mRNA-uttryck på ett semikvantitativtsätt 31,32. Western blotting används för att undersöka specifika proteinnivåer i ett givet celllyatprov med fördelar av känslighet och specificitet, på ett semikvantitativt sätt. Således presenterar vi ett systematiskt arbetsflöde för att analysera förändringar från genuttryck till proteinuttryck för att hjälpa till att undersöka TGF-β signalering som också kan tillämpas på andra signalvägar.
TGF-β/SMAD signalering spelar en central roll i bröstcancer progression, eftersom det kan främja bröstcancer cell invasivitet och metastasering genom att inducera EMT7. Här beskrev vi ett logiskt arbetsflöde för att undersöka TGF-β-initierad signalering från receptorinducerad SMAD-aktivering till SMAD-medierade transkriptionella och biologiska svar. Vi började med att beskriva analysen av SMAD2 fosforylering, fortsatte med TGF-β-inducerad SMAD3-beroende transkriptionssvar och EMT markör uttryck vid både genen och protein nivåer att analysera TGF-β/SMAD signalering svar, och slutligen undersökt TGF-β-inducerad EMT. Vi använde CAGA12-luciferase transcriptional reporter som innehåller CAGA lådor härrör från PAI-1 promotorn, för att övervaka aktiviteten hos TGF-β/SMAD signalväg35. Den här reporterkonstruktionen kräver SMAD3 och SMAD4 för aktivering. Tidigare studier har visat att knockdown av SMAD4 försvagade TGF-β-inducerad CAGA12-luciferase aktivitet37. Förutom reporteranalysen är fastställandet av fosforyleringsstatusen för endogena SMADs, inklusive SMAD2 och SMAD3, ett annat sätt att undersöka TGF-β signalsvar. Andra medlemmar av TGF-β-familjen, såsom tillväxt- och differentieringsfaktor (GDF)-8/myostatin och GDF-9, omvandlar också signaler via SMAD2/3-proteiner genom att engagera TβRI42,43,44. Förutom CAGA12-luciferase reporter, flera liknande reportrar har använts för att upptäcka aktivering av TGF-β signalering. Till exempel kan en transkriptionell (SBE)4-Lux-reporter med svarselement som härrör från JunB-promotorn effektivt induceras av TGF-β, aktiviner och BMPs45.
Western blotting och qPCR användes för att analysera TGF-β-inducerad EMT, som är klassiska metoder för att undersöka uttrycket av epitelial markörer (dvs. E-cadherin) och mesenchymal markörer (dvs. N-cadherin, Snail, Slug och Zeb2). Vi utförde också indirekt immunofluorescens färgning av E-cadherin och direkt fluorescens färgning av F-aktin. Dessa analyser validerade ytterligare mesenchymal fenotyp av celler efter TGF-β behandling. Begränsningen av immunofluorescensfärgning är att celler måste fixeras före inkubation med antikroppar och avbildning, och det är svårt att undersöka förändringar i EMT-marköruttryck i levande celler. Nyligen har utformningen av EMT-reporter cellinjer, såsom A549 lung adenocarcinom-vimentin-RFP, gjort det möjligt att övervaka omvandlingen av epitelceller till mesenchymala celler i realtid via uttryck av röda fluorescerande protein (RFP)-märkt vimentin. Denna plattform skulle kunna användas för läkemedelsscreening och ny läkemedelsutveckling46. LifeAct färgämne, en 17-aminosyra peptid, som kan färga F-aktin strukturer i levande celler, blir ett värdefullt verktyg för att visualisera aktin cytoskeleton i realtid utan att störa cellulära processer47. I denna studie använde vi två småmolekylhämmare, SB431542 och GW788388, för att validera deras hämmande effekt på TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT. GW788388 hämmar särskilt kraftigt aktiviteten i TβRI och TβRII, medan SB431542 endast har en hämmande effekt på TβRI (och ALK4 och ALK7). Tidigare studier visade att GW788388 är mer potent in vivo än SB43154240. Förutom hämningen av EMT minskade GW788388 uttrycket av fibrosmarkörer i njuren och oral administrering av GW788388 hos diabetiker möss minskade markant glomerulopati25,48.
EMT spelar en viktig roll för att främja cancercells plasticitet och resulterar i läkemedelsresistens och metastasering 49. Därför har inriktning på EMT-härledda celler med specifika cytotoxiskaläkemedel 50 eller inducera redifferentiering via mesenchymal-till-epitelial övergång (MET)51 föreslagits som ett tillvägagångssätt för att övervinna cancercellsmetastas och terapiresistens. Met bidrar dock till spridningen av spridade cancerceller i avlägsna organ52, vilket kan vara kontraproduktivt när man använder terapeutisk reversion av EMT. Nyligen rapporterade en ny studie en terapeutisk transdifferentieringsmetod genom att direkt rikta in sig på EMT-härledda bröstcancerceller för differentiering till adipocyter30. Studien av Ishay-Ronen et. 30 använde py2T-epitelcancerceller som hade genomgått en övergång till mesenkymala celler som svar på långtidsbehandling med TGF- β. De visade att rosiglitazon i kombination med MEK-hämmare förbättrade epitelial differentiering och adipogenesis. Vi fann dock att rosiglitazon ensam var tillräckligt för att inducera transdifferentiering av mesenchymal Py2T murin celler i adipocyter.
Sammanfattningsvis gav metoderna som används i denna studie ett logiskt arbetsflöde för att undersöka TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT. De två hämmarna, SB431542 och GW788388, kan blockera TGF-β-inducerade svar och EMT. Dessutom visade vi också rosiglitazone ensam inducerar adipogenesis i vissa TGF-β-inducerad mesenchymal bröstcancer celler. Även om vi bara använde flera bröstcancer cellinjer för att undersöka TGF-β svar, de metoder som beskrivs här kan extrapoleras till andra (cancer) celler. Här använde vi olika TGF-β koncentrationer för att inducera cellulära svar. I de flesta celltyper utövar TGF-β sin biologiska aktivitet i koncentrationsområdet 0,01-10 ng/ml53 och inducerar signalering i ett dosresponsmönster. I primära endotelceller, inklusive bovina kolorektal endotelceller, framkallade TGF-β det väsentliga uttrycket av fosforylerad SMAD2 vid 0,025 ng/mL, nådde ett maximum på 0,25 ng/mL och förblev på denna nivå som svar på högrekoncentrationer 53. I vår studie använde vi en hög koncentration av TGF-β (5 ng/mL) i MCF10A-Ras celler för transkriptionell reporter analys för att få starka svar. SMAD2 fosforylering och mål gen uttryck kan induceras av TGF-β vid en låg dos; Således använde vi 2,5 ng/mL TGF-β för att behandla celler. Den lämpligaste arbetskoncentrationen beror dock på celltyp och uppskattade effekter. För att bestämma den bästa koncentrationen av TGF-β rekommenderas behandling av cellerna med olika doser (från låg till hög).
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stödet från Chinese Scholarship Council (CSC) till J.Z. och Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) till P.t.D.
Reagent | |||
18 mm-side square glass coverslips | Menzel Gläser | 631-1331 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Alexa Fluor 555 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21422 | |
Anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | |
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody | Merck Millipore | MAB374 | |
Anti-N-cadherin antibody | BD Biosciences | 610920 | |
Anti-Slug antibody | Cell Signaling Technology | 9585 | |
anti-SMAD2/3 antibody | Becton Dickinson | 610842 | |
Anti-Snail antibody | Cell Signaling Technology | 3879 | |
Anti-Tubulin antibody | Cell Signaling Technology | 2148 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Cholera enterotoxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705060 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
DMEM-high glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
DMEM-high glucose medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11039047 | |
epidermal growth factor (EGF) | Merck Millipore | 01-107 | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWest | S1860-500 | |
GoTaq qPCR Master Mix | PROMEGA | A600X | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 26050088 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
NucleoSpin RNA II kit | BIOKE´ | 740955 | |
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Skimmed milk | Campina: Elk | ||
Equipment | |||
ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001402 | |
CFX Connect Detection System | Bio-Rad | 1855201 | |
Luminometer | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 |