Deneysel Otoimmün Üveit: Göz İçi İnflamatuar Bir Fare Modeli
Summary
Bu yazıda, araştırmacının göz içi üveitinin fare modelini oluşturmasını sağlayan bir protokol sunuyoruz. Daha yaygın olarak deneysel otoimmün üveit (EAU) olarak adlandırılan bu yerleşik model, insan hastalığının birçok yönünü yakalar. Burada, birkaç okuma kullanarak hastalığın ilerlemesinin nasıl indükleneceğini ve izleneceğini açıklayacağız.
Abstract
Deneysel Otoimmün Üveit (EAU), kendi kendine antijenlere yanıt veren immün hücreler tarafından yönlendirilir. Bu enfeksiyöz olmayan, göz içi inflamatuar hastalık modelinin birçok özelliği, insanları etkileyen posterior üveitin klinik fenotipini özetlemektedir. EAU, yeni inflamatuar terapötiklerin etkinliğini, etki biçimlerini incelemek ve göz içi bozuklukların hastalık ilerlemesini destekleyen mekanizmaları daha fazla araştırmak için güvenilir bir şekilde kullanılmıştır. Burada, bu hastalığa duyarlılığı olan en yaygın kullanılan model organizma olan C57BL / 6J farede EAU indüksiyonu hakkında ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Hastalığın şiddeti ve progresyonunun klinik değerlendirmesi fundoskopi, histolojik inceleme ve floresein anjiyografi ile gösterilecektir. İndüksiyon prosedürü, oküler protein interfotoreseptör retinoid bağlayıcı proteinden (retinol bağlayıcı protein 3 olarak da bilinir), Complete Freund’s Adjuvant’tan (CFA) bir peptid (IRBP1-20) içeren bir emülsiyonun deri altı enjeksiyonunu içerir ve öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis ile desteklenir. Bu viskoz emülsiyonun boynun arkasına enjeksiyonunu, Bordetella boğmaca toksininin tek bir intraperitoneal enjeksiyonu izler. Semptomların başlangıcında (12-14. gün) ve genel anestezi altında, klinik muayene yoluyla hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için fundoskopik görüntüler alınır. Bu veriler, daha sonraki zaman noktalarında ve pik hastalıkta (20-22. gün) analiz edilen farklılıklarla doğrudan karşılaştırılabilir. Aynı zamanda, bu protokol, araştırmacının floresein anjiyografi kullanarak damar geçirgenliği ve hasarındaki potansiyel farklılıkları değerlendirmesini sağlar. EAU, diğer fare suşlarında (hem vahşi tipte hem de genetiği değiştirilmiş olarak) indüklenebilir ve ilaç etkinliğini ve / veya hastalık mekanizmalarını incelemek için esneklik sunan yeni tedavilerle birleştirilebilir.
Introduction
Bu protokol, C57BL / 6J farede Deneysel Otoimmün Üveitin (EAU) emülsifiye bir adjuvanda retinal antijenin tek bir deri altı enjeksiyonu ile nasıl indükleneceğini gösterecektir. Hastalığın ilerlemesini izleme ve değerlendirme yöntemleri, fundoskopik görüntüleme ve histolojik inceleme ile detaylandırılacak ve ölçüm parametreleri ana hatlarıyla belirtilecektir. Ayrıca retinal kan damarı yapısını ve geçirgenliğini incelemek için kullanılan bir teknik olan floresein anjiyografi tartışılacaktır.
Bu EAU modeli, insanlarda enfeksiyöz olmayan posterior üveitin klinik patolojik özellikleri ve hastalığı yönlendiren temel hücresel ve moleküler mekanizmalar açısından merkezi özelliklerini özetlemektedir. EAU, evlat edinilmiş transfer deneylerinde ve IFNγ tükenmiş farelerde gösterildiği gibi, kendi kendine reaktif CD4 + T lenfositlerin Th1 ve / veyaTh17 alt kümeleri tarafından aracılık edilir. Üveitte bu hücrelerin potansiyel rolleri hakkındaki anlayışımızın çoğu, retina dokularında hem Th1 hem de Th17 hücrelerinin tespit edildiği EAU2’yi incelemekten kaynaklanmaktadır3. Genellikle, EAU hastalığı hafifletmede yeni tedavilerin yararını değerlendirmek için klinik öncesi bir model olarak kullanılır. EAU hastalığını başarılı bir şekilde modüle eden terapötik yaklaşımlar klinikte bir miktar etkinlik göstermiş ve FDA onaylı statüye ulaşmıştır. Bunların örnekleri, T hücre hedefleme tedavileri gibi immünoregülatör ilaç gruplarıdır: siklosporin, FK-506 ve rapamisin 4,5,6. Son zamanlarda, bu modelde hem mekanizmayı hem de hastalık sonucu üzerindeki etkisini araştırmak için yeni yolları hedefleyen müdahaleler de araştırılmıştır. Bunlar, kromatin okuyucu Bromodomain Ekstra-Terminal (BET) proteinleri ve P-TEFb inhibitörleri3 aracılığıyla transkripsiyonel düzenlemeyi hedeflemeyi içerir. Ayrıca, VLA-4 inhibitörü gibi daha geleneksel yaklaşımlar son zamanlarda efektör CD4 + T hücrelerinin modülasyonu yoluyla EAU’da baskılanma göstermiştir7. Ek olarak, bir RORγt ters agonisti olan TMP778 ile Th17 hücrelerini hedeflemenin de EAU8’i önemli ölçüde baskıladığı bulunmuştur. Ayrıca, bu model retinadaki kronik otoimmün inflamasyonu ve lenfosit primasyonu gibi eşlik eden altta yatan mekanizmaları incelemek için bir fırsat sunmaktadır.
EAU preklinik çalışmaları için birincil okumalar, retinal fundoskopi görüntülemesi yapılarak ve daha az sıklıkla, Optik Koherens Tomografi (OCT) ile retina bütünlüğünün değerlendirilmesi yoluyla klinik değerlendirmedir. Daha sonra retinal histopatolojik değerlendirme ve retina hücrelerinin akım sitometrisi ile immünofenotiplenmesi terminasyonda yapılır. Fundoskopi, tüm retinanın hızlı ve tekrarlanabilir klinik değerlendirmesine olanak tanıyan, kullanımı kolay bir canlı görüntüleme sistemidir. İmmünohistokimyasal değerlendirmeler için, teknikler, inflamasyon ve yapısal hasar derecesi için doku mimarisini incelememize izin veren retinal kesitlerin hazırlanmasına dayanmaktadır9. Kullanılan tüm teknikler için değerlendirme kriterleri ve geleneksel puanlama sistemleri bu protokolde özetlenecektir. Fundoskopik görüntüleme kullanılarak kaydedilen hasarın boyutu genellikle histolojik değişikliklerle yakından ilişkilidir. Hastalığın ciddiyetini izlemeye ve değerlendirmeye yönelik bu ikili yaklaşım, daha fazla hassasiyet ve daha güvenilir ölçüm sonuçları sağlar.
EAU preklinik testler ve immün aracılı göz hastalığının araştırılması için iyi kurulmuş, yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bu model, %95 > hastalık insidansı ile güvenilir ve tekrarlanabilir olup, dünya çapında çalışma yaşı körlüğünün önemli bir nedenini temsil eden göz içi inflamatuar hastalığın tedavisi için yeni tedavileri doğrulamak veya reddetmek için kullanılabilecek kapsamlı veriler üretir10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneysel hayvan modelleri, hastalık patogenezini incelemek ve yeni terapötik paradigmaların klinik öncesi testlerini incelemek için gerekli araçlardır. Bu protokolde, göz içi inflamatuar üveitin deneysel bir modeli olan EAU’yu indüklemek, izlemek ve puanlamak için bir metodolojiyi tartıştık. Bu EAU modeli, tüm prosedürler burada özetlenen protokole göre yapıldığında hastalık insidansı% 95’ten fazladır ve kronik, monofazik EAU’nun gelişmesiyle sonuçlanır. Bu insidans seviyesine ulaşmak için,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG, CB’yi desteklemek için UCL Etki Öğrenciliği ve Rosetrees Trust fonu ile ödüllendirildi. VC, Akari Therapeutics Inc.’den bir araştırma işbirliği hibesi alıyordu. UCL Oftalmoloji Enstitüsü, Biyolojik Hizmet Birimi, özellikle Bayan Alison O’Hara ve ekibine teknik destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
