Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas
Summary
Este trabalho descreve um protocolo para alcançar o monitoramento dinâmico e não invasivo da transferência de calor de nanopartículas de ouro irradiadas a laser para tBLMs. O sistema combina espectroscopia de impedância para a medição em tempo real de mudanças de condução através dos tBLMs, com um raio laser horizontalmente focado que impulsiona a iluminação de nanopartículas de ouro, para produção de calor.
Abstract
Aqui relatamos um protocolo para investigar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro irradiadas (GNPs) e membranas lipídicas bicamadas por eletroquímica usando membranas lipídicas bicamadas amarradas (tBLMs) montadas em eletrodos de ouro. Os GNPs modificados irradiados, como os GNPs conjugados com estreptavidina, estão incorporados em tBLMs contendo moléculas-alvo, como a biotina. Usando essa abordagem, os processos de transferência de calor entre GNPs irradiados e membrana lipídica bicamada modelo com entidades de interesse são mediados por um raio laser horizontalmente focado. O modelo computacional preditivo térmico é usado para confirmar as mudanças de condutância eletroquimicamente induzidas nos tBLMs. Sob as condições específicas utilizadas, a detecção de pulsos de calor exigia fixação específica das nanopartículas de ouro à superfície da membrana, enquanto as nanopartículas de ouro não ligadas não conseguiram obter uma resposta mensurável. Esta técnica serve como um poderoso biosensor de detecção que pode ser utilizado diretamente para o design e desenvolvimento de estratégias para terapias térmicas que permitem a otimização dos parâmetros de laser, tamanho das partículas, revestimentos de partículas e composição.
Introduction
O desempenho hipertérmico de nanomateriais de ouro irradiado oferece uma nova classe de tratamento minimamente invasivo, seletivo e direcionado para infecções e tumores1. O emprego de nanopartículas que podem ser aquecidas por um laser tem sido usado para destruir seletivamente células doentes, bem como fornecer um meio para o parto seletivo de medicamentos2,3. Uma consequência dos fenômenos da fototermólise de nanopartículas plasmônicas aquecidas é danos às membranas celulares. A membrana de bicamadas lipídicas fluidas é considerada um local particularmente vulnerável para as células submetidas a tais tratamentos, pois a desnaturação de proteínas de membrana intrínseca, bem como danos à membrana, também pode levar à morte celular4, já que muitas proteínas estão lá para manter o gradiente potencial iônico entre as membranas celulares. Embora a capacidade de determinar e monitorar a transferência de calor na nanoescala seja de interesse fundamental para o estudo e aplicação de GNPs irradiados1,5,6,7, avaliação e compreensão das interações moleculares entre GNPs e bio-membranas, bem como as consequências diretas dos fenômenos de aquecimento induzidos a laser de GNPs incorporados em tecidos biológicos, ainda estão para ser totalmente elucidado8. Portanto, uma compreensão completa do processo de hipertermia dos GNPs irradiados continua a ser um desafio. Como tal, o desenvolvimento de uma interface nanomaterial-eletrodo que imita o ambiente natural das células poderia fornecer um meio para realizar uma investigação aprofundada das características de transferência de calor de nanopartículas de ouro irradiadas dentro de sistemas biológicos.
A complexidade das membranas celulares nativas é um dos desafios significativos na compreensão das interações irradiadas de GNPs nas células. Existem várias plataformas de membrana artificial desenvolvidas para fornecer versões bio miméticas simples de arquitetura e funcionalidade de membrana lipídica natural, incluindo, mas não se limitando a, membranas lipídicas pretas9,membranas bicamadas apoiadas10,membranas bicamadas híbridas11,membranas lipídicas com almofadas de polímero12 e membranas lipídicas bicamadasamarradas 13. Cada modelo de membrana lipídica artificial tem vantagens e limitações distintas no que diz respeito à imitação das membranas lipídicas naturais14.
Este estudo descreve o emprego de eletrodos revestidos de membrana lipídica como um sensor para avaliar as interações de nanopartículas de ouro e membrana lipídica, utilizando o modelo tBLM. O esquema de detecção de biosensor baseado em tBLM fornece estabilidade e sensibilidade inerentes13, pois as membranas amarradas podem se auto-reparar, ao contrário de outros sistemas (como membranas formadas por patch-clamp ou lipossomos) em que apenas uma pequena quantidade de dano de membrana resulta em seu colapso15,16,17,18. Além disso, como os tBLMs são de dimensões mm2, a impedância de fundo é ordens de magnitude inferiores às técnicas de gravação de grampos, o que permite o registro de alterações no fluxo iônico da membrana basal devido às interações com nanopartículas. Como resultado disso, o presente protocolo pode contrastar mudanças na condutância da membrana por GNPs vinculados que são animados por lasers cujos poderes são tão baixos quanto 135 nW/μm2.
O sistema aqui apresentado fornece um método sensível e reprodutível para determinar parâmetros precisos de laser, tamanho de partículas, revestimentos de partículas e composição necessários para projetar e desenvolver terapias térmicas. Isso é fundamental para o refinamento de terapias fototérmicas emergentes, além de oferecer informações valiosas para mecanismos detalhados de transferência de calor dentro de sistemas biológicos. O protocolo apresentado baseia-se no trabalho publicado anteriormente19. Um esboço do protocolo é o seguinte: a primeira seção define a formação tBLM; a segunda seção descreve como construir a configuração e alinhar a fonte de laser de excitação; a seção final ilustra como extrair informações dos dados de espectroscopia de impedância elétrica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve o uso do modelo tBLM com um substrato de eletrodos coplanar em conjunto com uma configuração de alinhamento a laser horizontal que permite a gravação de impedância elétrica em tempo real em resposta à irradiação a laser de nanopartículas de ouro. O método de gravação do EIS apresentado aqui constrói uma lista mínima de experimentos necessários para fornecer o registro de mudanças de corrente de íon em toda a membrana, o que corresponde ao calor ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Descoberta do Conselho de Pesquisa Australiano (ARC) (DP150101065) e pelo Arc Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).
Materials
| 30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
| 30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
| Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
| C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
| Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
| Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
| 532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
| tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
| tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
| tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
| 99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |
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