כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להנדסת גנום מבוסס CRISPR / Cas9 של תאי B אנושיים ראשוניים לנוקאאוט גנים (KO) ו knock-in (KI) כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים בתאי B ופיתוח של טיפולי B-cell.
תאי B הם לימפוציטים שמקורם בתאי גזע ההמטוטופיאטיים והם מרכיב מרכזי בזרוע ההומוריסטית של מערכת החיסון האדפטיבית. הם עושים מועמדים אטרקטיביים לטיפולים מבוססי תאים בגלל קלות הבידוד שלהם מדם היקפי, היכולת שלהם להתרחב במבחנה, ואת תוחלת החיים שלהם vivo. בנוסף, ניתן להשתמש בתפקוד הביולוגי התקין שלהם – כדי לייצר כמויות גדולות של נוגדנים – כדי לבטא כמויות גדולות מאוד של חלבון טיפולי, כגון נוגדן רקומביננטי למלחמה בזיהום, או אנזים לטיפול באנזימופתיות. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לבידוד תאי B אנושיים ראשוניים מתאי מונונוקלור דם היקפיים (PBMCs) והפעלה/הרחבה של תאי B מבודדים במבחנה. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים הכרוכים בשימוש במערכת CRISPR/Cas9 עבור KO ספציפי לאתר של גנים אנדוגניים בתאי B. שיטה זו מאפשרת KO יעיל של גנים שונים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של גנים מעניינים. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים לשימוש במערכת CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור רקומביננטי, הקשור לאדנו, ויראלי (rAAV) לשילוב יעיל ספציפי לאתר של קלטת ביטוי טרנסג’ין בתאי B. יחד, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה הנדסית צעד אחר צעד שניתן להשתמש בה בתאי B אנושיים ראשוניים כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים, כמו גם לפיתוח טיפולי B-cell.
תאי B הם תת-קבוצה של שושלת הלימפוציטים המופקת מתאי גזע hematopoietic. הם מבצעים תפקיד קריטי במערכת החיסון ההומוריסטית האדפטיבית על ידי ייצור כמויות גדולות של נוגדנים בתגובה לאתגרים החיסוניים1. תאי B הם גם סימנים מקדימים של תאי זיכרון B ותאי פלזמה מובחנים, ארוכי טווח, ובכך מספקים חסינות הומוריסטית מתמשכת2. תאי פלזמה, בפרט, הם ייחודיים בקרב תאי החיסון ביכולתם לייצר כמויות גדולות של נוגדן מסוים תוך כדי הישרדות במשך שנים או עשרות שנים3. בנוסף, קלות הבידוד מדם היקפי הופכת את שושלת התאים B למועמד מצוין לטיפולים חדשניים מבוססי תאים4.
בעבר, שיטות אינטגרציה אקראיות, כגון אלה באמצעות וקטורים lentiviral או טרנספוזון היפהפייה הנרדמת, שימשו להנדסת תאי B עבור משלוח transgene וביטוי5,6,7,8. עם זאת, האופי הלא ספציפי של גישות אלה מקשה על חקר הפונקציות הביולוגיות של גן מסוים בתאי B ונושא סיכון אינהרנטי של מוטגנזה הכנסתית וביטוי טרנסג’ין משתנה ו / או השתקה בסביבה הטיפולית.
מערכת CRISPR/Cas9 היא כלי הנדסת גנום רב עוצמה המאפשר לחוקרים לערוך במדויק את הגנום של תאים שונים במינים רבים. לאחרונה, שתי קבוצות, כולל שלנו, פיתחו בהצלחה שיטות להרחבת ex vivo והנדסת גנום ממוקדת של תאי B אנושיים ראשוניים9,10. נתאר את התהליך של טיהור תאי B אנושיים ראשוניים מדגם לוקאפורזיס. לאחר מכן, נתאר את הפרוטוקול המעודכן שלנו להרחבת תאי B ולהפעלה של תאי B מבודדים. לאחר מכן נתאר תהליך להדחת אשכול של בידול 19 (CD19), קולטן B-cell ספציפי וסימן ההיכר של תאי B, על ידי electroporation להציג CRISPR / Cas9 mRNA יחד עם CD19 sgRNA לתוך תאי B פעילים.
Cas9 mRNA מתורגם ונקשר ל- CD19 sgRNA כדי ליצור קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) CRISPR/Cas9-sgRNA. לאחר מכן, sgRNA במתחם מוביל Cas9 ליצור שבר גדיל כפול (DSB) ברצף היעד על exon 2 של הגן. התאים יתקנו את ה- DSB על ידי “הצטרפות קצה לא הומולוגית” על ידי החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים, מה שיוביל למוטציה של frameshift ויגרום לגן להיות בנוקאאוט. לאחר מכן נמדוד את אובדן CD19 על ידי ציטומטריית זרימה וננתח היווצרות אינדל על ידי מעקב אחר אינדלים על ידי ניתוח פירוק (TIDE).
לאחר מכן נתאר את תהליך השימוש ב- CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור AAV6 רקומביננטי (rAAV6, תבנית תורמת לתיקון מונחה הומולוגיה (HDR)) כדי לתווך בהכנסה ספציפית לאתר של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר(EGFP) בגן שילוב וירוסים הקשורים לאדנו 1 (AAVS1). גן AAVS1 הוא מוקד פעיל ללא פונקציות ביולוגיות ידועות ואתר אינטגרציה נגיפי AAV על הגנום האנושי; לכן, הוא נחשב “נמל בטוח” להנדסת גנום. כאן אנו מדווחים כי התרחבות והפעלה של תאי B אפשרו התרחבות של עד פי 44 ב-7 ימי תרבות (איור 1). אלקטרופורציה של תאי B הראתה ירידה קלה בבריאות הכללית של התאים (איור 2A) ב-24 שעות לאחר ההעברה. ניתוח התוויית פיזור של סמן CD19 (איור 2B) הראה ירידה של עד 83% בתאים הערוכים (איור 2C).
ניתוח TIDE של הכרומטוגרפים (איור 3A) גילה כי % indels היה דומה לאחוז אובדן החלבון על ידי ציטומטריית זרימה(איור 3B). ניתוח ציטומטריה זרימה של ניסוי KI הראה כי התאים שקיבלו וקטור AAV (איור 4), יחד עם RNP, הביעו עד 64% תאים חיוביים ל- EGFP (איור 5A) ומאוחר יותר הציגו אינטגרציה מוצלחת על ידי תגובת שרשרת פולימראז צומת (PCR) (איור 5B). ספירת תאים הראתה כי כל הדגימות התאוששו במהירות בתוך 3 ימים לאחר ההנדסה (איור 5C).
הנדסת גנום מדויקת בתאי B אנושיים ראשוניים הייתה מאתגרת עד לאחרונה9,10. פרסמנו בעבר פרוטוקולים באמצעות CRISPR/Cas9 כדי להנדס תאי B אנושיים ראשוניים9. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים משופרים עבור בידוד B-cell, הרחבה, והנדסה כדי לאפשר KO יעיל של CD19 או לדפוק ב EGFP</e…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי הקרן לחקר הסרטן לילדים (CCRF) ו NIH R01 AI146009 כדי B.S.M.
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |