여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
B 세포는 조혈 줄기 세포에서 파생된 림프구이며 적응성 면역 계통의 유머 팔의 핵심 성분입니다. 그(것)들은 말초 혈액에서 고립의 그들의 용이성 때문에 세포 기지를 둔 치료를 위한 매력적인 후보자, 시험관에서 확장하는 그들의 기능 및 생체 내의 그들의 장수 때문에. 또한, 그들의 정상적인 생물학적 기능-많은 양의 항체를 생산 하는-감염 을 싸우는 재조합 항체 와 같은 치료 단백질의 매우 많은 금액을 표현 하기 위해 활용 될 수 있다, 또는 효소 의 치료를 위한 효소. 여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 1 차인간 B 세포를 격리하고 시험관 내에서 고립된 B 세포를 활성화/확장하는 상세한 방법을 제공합니다. 그런 다음 B 세포에서 내인성 유전자의 사이트 별 KO를 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 데 관련된 단계를 시연합니다. 이 방법은 관심있는 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 다양한 유전자의 효율적인 KO를 허용합니다. 그런 다음 CrispR/Cas9 시스템을 B 세포에서 트랜스진 발현 카세트의 효율적인 현장 별 통합을 위한 재조합, 아데노 관련, 바이러스(rAAV) 벡터와 함께 사용하는 단계를 시연합니다. 이 프로토콜은 유전자의 생물학적 기능뿐만 아니라 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 1 차 인간 B 세포에서 사용할 수 있는 단계별 엔지니어링 플랫폼을 제공합니다.
서론
B 세포는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 림프구 계보의 하위 그룹이다. 그(것)들은 면역 도전1에응하여 항체의 다량을 생성하여 적응성 유머 면역 계통에 있는 중요한 역할을 능력을 발휘합니다. B세포는 또한 기억 B 세포의 전구체이며 말단 분화되고 수명이 긴 혈장 세포로, 지속적인 유머 면역2를제공한다. 플라즈마 세포, 특히, 년 또는 수십 년 동안 생존하는 동안 특정 항체의 다량을 생산하는 능력에 면역 세포 중 고유3. 또한, 말초 혈액으로부터의 분리의 용이성은 B 세포 혈통을 새로운 세포 기반 치료에 대한 우수한 후보로 만든다4.
이전에는 렌티바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포슨을 사용하는 것과 같은 임의의 통합 방법이 트랜스진 전달 및 발현5,6,7,8을위해 B 세포를 설계하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이들 접근법의 비특....
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프로토콜
건강한 기증자로부터 류카페레시스 샘플을 현지 혈액 은행에서 수득하였다. 여기에 설명된 모든 실험은 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 연구를 면제하기로 결정하고 미네소타 대학의 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 모든 실험은 멸균/무균 기술과 적절한 생물안전 수준-2 장비로 혈중 병원체에 대한 보편적인 예방 조치에 따라 수행되었습니다.
1. B 세포 확장 매체에 대한 보충제 를 준비
- CpG 올리고뉴클레오티드를 1 mg/mL의 농도로 재구성합니다.
- CD40 리간드(CD40L)를 100 μg/mL의 농도로 재구성합니다.
- 재구성 인간 IL-10 (rhIL-10) 50 μg/mL의 농도.
- 재조합 인간 IL-15(rhIL-15)를 10 μg/mL의 농도로 재구성한다.
참고: 각 보충제를 -20°C ~ -80°C에서 최대 6개월 동안 작은 알리쿼트에 보관하십시오.
2. 기저 매질 준비
- B 세포 기저 배지를 체외 면역 세포 확장(예를 들어, CTS 면역 세포 SR) 및 1% (v/v) 페니실린 및 연쇄상 구균신을 위한 배지 보....
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결과
업데이트된 확장 및 활성화 프로토콜은 7일 만에 최대 44배까지 B 셀의 급속한 확장을 가능하게하였다(그림 1;n=3 기증자). KO 실험에서, Trypan 블루 염색을 이용한 B 세포 수는 24시간 전기포화에서 대조군 과 CD19 KO 샘플 모두에서 세포 회수가 약간 감소하는 80% 이상의 실행 가능한 세포를보였다(도 2A;p ≥ 0.05, n=3 기증자). 이 결과는 전기기분해가 전반적인 B 세포 건강에 약간 영향을 미쳤다는 것을 나타냅니다. B 세포는 유동 세포측정 및 TIDE 분석을 위해 5일째 에 배혈 후 를 수집하였다. 대조군 및 KO 샘플의 대표적인 분산 플롯은 각각 14% 및 95% CD19-음수 세포를나타냈다(도 2B). 유동 플롯의 양은 대조군(도2B;p ≤ 0.0001, n=3 기증자)에 비해 KO.......
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토론
1차 인간 B 세포에 있는 정확한 게놈 공학은 최근9,10까지도전적이고 있습니다. 우리는 이전에 CRISPR / Cas9를 사용하여 기본 인간 B 세포9을설계하는 프로토콜을 발표했습니다. 여기서는 CD19의 효율적인 KO 또는 노크인 EGFP를 위해 B-셀 격리, 확장 및 엔지니어링을 위한 향상된 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
여기서 우리는 우리의 확장 프로토콜이 7 일(그림 1)에서최대 44 배 의 확장에 대한 배양B 세포의 급속한 확장을 허용한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 Johnson 외9 및 Hung 외. 10에 의해 보고된 것보다 더 빠른 확장.......
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공개 사항
M.J.J. K.L., B.S.M를 발명자로 사용하여 게놈 편집 B 세포를 만들고 사용하는 방법에 대한 특허가 출원되었습니다. B.S.M 는 임무소프트의 주식을 컨설턴트로 운영하고 있으며, B.S.M 연구소에서 연구를 후원하고 있습니다.
감사의 글
이 작품은 어린이 암 연구 기금 (CCRF)과 NIH R01 AI146009에서 B.S.M에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 단백질, 500 ug | IDT | 1081059 | 더 작은 크기도 사용 가능 |
| Amaxa P3 일차 세포 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| 암모늄-염화-칼륨 (ACK) 용해 완충액 | 품질 생물학 | 118-156-101 | |
| CleanCap 화학적으로 변형된 Cas9 mRNA | Trilink 생명공학 | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | 다양한 크기 사용 |
| 가능 Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| 엑셀레레이트 B 세포 배지, 무제계 R | & D Systems | CCM031 | B-cell 기초 매체 |
| Falcon 14 mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브 | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R& D Systems | S11550 | B 세포 전용 |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 개별 돔 캡이 부착된 8-Strip 0.2 mL PCR 튜브 | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) 또는 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector 코어 유닛 | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | 동결 세포용 |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | 더 작은 크기는 또한 |
| 유효합니다 rAAV6 SA-GFP pakaging (우리의 SA-GFP 카세트에, 숫자 4를 보십시오.) | Vigene Biosciences | N/A | 대규모 패키징, 1e13 GC/mL, 500mL |
| 재조합 인간 IL-10 단백질 250ug | R& D Systems | 217-IL-250 | 다양한 크기 사용 가능 |
| 재조합 인간 IL-15 단백질 25 ug | R& D Systems | 247-ILB-025 | 다양한 크기 사용 |
| 가능 Big Easy EasySep 자석 | STEMCELL Technology | 18001 | 다양한 크기 사용 가능 |
| Tris-EDTA (TE) 버퍼 | Fisher Scientific | BP2476100 |
참고문헌
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka,....
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재인쇄 및 허가
