Måling af strial blodgennemstrømning i musecochlea ved hjælp af et åbent karvindue og intravital fluorescensmikroskopi
Summary
En åben kar-vinduestilgang ved hjælp af fluorescerende sporstoffer giver tilstrækkelig opløsning til cochlear blodgennemstrømning (CoBF) måling. Metoden letter undersøgelsen af strukturelle og funktionelle ændringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold.
Abstract
Transduktion af lyd er metabolisk krævende, og den normale funktion af mikrovaskulaturen i sidevæggen er afgørende for at opretholde endodocochlearpotentiale, iontransport og væskebalance. Forskellige former for hørelidelser rapporteres at involvere unormal mikrocirkulation i cochlea. Undersøgelse af, hvordan cochlear blodgennemstrømning (CoBF) patologi påvirker hørefunktionen, er udfordrende på grund af manglen på gennemførlige forhørsmetoder og vanskeligheden ved at få adgang til det indre øre. Et åbent karvindue i den laterale cochlearvæg kombineret med fluorescens intravital mikroskopi er blevet brugt til at studere CoBF-ændringer in vivo, men mest hos marsvin og først for nylig i musen. Dette papir og den tilhørende video beskriver den åbne kar-vinduesmetode til visualisering af blodgennemstrømningen i musens cochlea. Detaljer omfatter 1) forberedelse af den fluorescerende mærkede blodcellesuspension fra mus; 2) konstruktion af et åbent karvindue til intravital mikroskopi i en bedøvet mus, og 3) måling af blodgennemstrømningshastighed og volumen ved hjælp af en offline optagelse af billeddannelsen. Metoden præsenteres i videoformat for at vise, hvordan man bruger open window-tilgangen i mus til at undersøge strukturelle og funktionelle ændringer i cochlear-mikrocirkulationen under normale og patologiske forhold.
Introduction
Normal funktion af mikrocirkulationen i den laterale cochlearvæg (der omfatter størstedelen af kapillærerne i spiralbåndet og stria vascularis) er kritisk vigtig for at opretholde hørefunktionen1. Unormal CoBF er impliceret i patofysiologien af mange indre ørelidelser, herunder støjinduceret høretab, ørehydrops og presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering af intravital CoBF vil muliggøre en bedre forståelse af sammenhængen mellem hørefunktion og cochlear vaskulær patologi.
Selvom kompleksiteten og placeringen af cochlea i den tidsmæssige knogle udelukker direkte visualisering og måling af CoBF, er der udviklet forskellige metoder til vurdering af CoBF, herunder laser-doppler flowmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroendoskopi (FME)15, endoskopisk laserplet kontrastbilleddannelse (LSCI)16 og tilgange baseret på injektion af mærkede markører og radioaktivt mærkede mikrosfærer i blodbanen (optisk mikroangiografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen af disse metoder har dog muliggjort absolut realtidssporing af ændringer i CoBF in vivo, med undtagelse af FIVM. FIVM, i kombination med et karvindue i den laterale cochlearvæg, er en tilgang, der er blevet brugt og valideret i marsvin under forskellige forsøgsbetingelser af forskellige laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metode blev med succes etableret til at studere de strukturelle og funktionelle ændringer i cochlearmikrocirkulationen i mus ved hjælp af fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran som kontrastmedium og fluorescensfarvestof – enten DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat, grøn) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyaninperchlorat, rød)-til formærkning af blodlegemer, visualisering af kar og sporing af blodgennemstrømningshastighed. I denne undersøgelse er protokollen for denne metode blevet beskrevet til billeddannelse og kvantificering af ændringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold (såsom efter støjeksponering). Denne teknik giver forskeren de nødvendige værktøjer til at undersøge de underliggende mekanismer i CoBF relateret til høredysfunktion og patologi i stria vascularis, især når de anvendes sammen med let tilgængelige transgene musemodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir demonstrerer, hvordan kapillærer i den cochleære sidevæg (og i stria vascularis) i en musemodel kan visualiseres med fluorophormærkning i et åbent karvinduespræparat under et FIVM-system. Musemodel er meget udbredt og foretrukket som en pattedyrsmodel til undersøgelse af menneskers sundhed og sygdom. Protokollen beskrevet her er en gennemførlig tilgang til billeddannelse og undersøgelse af CoBF i musens laterale væg (især i stria vascularis) ved hjælp af et åbent karvindue under FIVM-systemet Met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) og Medical Research Foundation fra Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
