Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale
Summary
Un approccio a finestra vaso aperta che utilizza traccianti fluorescenti fornisce una risoluzione sufficiente per la misurazione del flusso sanguigno cocleare (CoBF). Il metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali e funzionali del CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche.
Abstract
La trasduzione del suono è metabolicamente impegnativa e la normale funzione della microvascolarizzazione nella parete laterale è fondamentale per mantenere il potenziale endococleare, il trasporto ionico e l’equilibrio dei fluidi. Diverse forme di disturbi dell’udito sono segnalati per coinvolgere la microcircolazione anormale nella coclea. L’indagine su come la patologia del flusso sanguigno cocleare (CoBF) influisce sulla funzione uditiva è impegnativa a causa della mancanza di metodi di interrogazione fattibili e della difficoltà di accesso all’orecchio interno. Una finestra aperta del vaso nella parete cocleare laterale, combinata con la microscopia intravitale a fluorescenza, è stata utilizzata per studiare i cambiamenti di CoBF in vivo, ma soprattutto nella cavia e solo recentemente nel topo. Questo documento e il video associato descrivono il metodo della finestra del vaso aperto per visualizzare il flusso sanguigno nella coclea del topo. I dettagli includono 1) preparazione della sospensione di cellule del sangue marcata con fluorescenza dai topi; 2) costruzione di una finestra vasale aperta per microscopia intravitale in un topo anestetizzato e 3) misurazione della velocità e del volume del flusso sanguigno utilizzando una registrazione offline dell’imaging. Il metodo è presentato in formato video per mostrare come utilizzare l’approccio a finestra aperta nel topo per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nel microcircolo cocleare in condizioni normali e patologiche.
Introduction
La normale funzione del microcircolo nella parete cocleare laterale (che comprende la maggior parte dei capillari nel legamento a spirale e nella stria vascolare) è di fondamentale importanza per il mantenimento della funzione uditiva1. Il CoBF anormale è implicato nella fisiopatologia di molti disturbi dell’orecchio interno, tra cui la perdita dell’udito indotta dal rumore, l’idrope dell’orecchio e la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualizzazione del CoBF intravitale consentirà una migliore comprensione dei legami tra funzione uditiva e patologia vascolare cocleare.
Sebbene la complessità e la posizione della coclea all’interno dell’osso temporale precludano la visualizzazione diretta e la misurazione del CoBF, sono stati sviluppati vari metodi per la valutazione del CoBF tra cui la flussimetria laser-doppler (LDF)10,11,12, la risonanza magnetica (MRI)13, la microscopia intravitale a fluorescenza (FIVM)14, la microendoscopia a fluorescenza (FME)15, l’imaging endoscopico a contrasto laser speckle (LSCI)16 , e approcci basati sull’iniezione di marcatori marcati e microsfere marcate radioattivamente nel flusso sanguigno (microangiografia ottica, OMAG)17,18,19,20. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha consentito il monitoraggio assoluto in tempo reale delle variazioni del CoBF in vivo, ad eccezione di FIVM. FIVM, in combinazione con una finestra del vaso nella parete cocleare laterale, è un approccio che è stato utilizzato e validato in cavie in diverse condizioni sperimentali da vari laboratori 14,21,22.
È stato stabilito con successo un metodo FIVM per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nella microcircolazione cocleare nel topo utilizzando isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano come mezzo di contrasto e un colorante di fluorescenza – DiO (3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina perclorato, verde) o Dil (1,1-diottadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina perclorato, rosso) – per premarcare le cellule del sangue, visualizzare i vasi e monitorare la velocità del flusso sanguigno. Nel presente studio, il protocollo di questo metodo è stato descritto per l’imaging e la quantificazione dei cambiamenti nel CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche (come dopo l’esposizione al rumore). Questa tecnica fornisce al ricercatore gli strumenti necessari per studiare i meccanismi alla base del CoBF correlati alla disfunzione uditiva e alla patologia nella stria vascolare, specialmente se applicata in combinazione con modelli murini transgenici prontamente disponibili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo dimostra come i capillari nella parete laterale cocleare (e nella stria vascularis) di un modello murino possono essere visualizzati con l’etichettatura fluoroforica in una preparazione di finestra del vaso aperta sotto un sistema FIVM. Il modello murino è ampiamente utilizzato e preferito come modello di mammifero per studiare la salute e le malattie umane. Il protocollo qui descritto è un approccio fattibile per l’imaging e lo studio del CoBF nella parete laterale del topo (in particolare nella stria …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata da NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) e Medical Research Foundation della Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
