열린 혈관 창과 생체 내 형광 현미경을 사용한 마우스 달팽이관의 심방 혈류 측정
Summary
형광 추적자를 사용하는 개방형 혈관 창 접근 방식은 달팽이관 혈류(CoBF) 측정에 충분한 분해능을 제공합니다. 이 방법은 정상 및 병리학 적 조건에서 마우스에서 CoBF의 구조적 및 기능적 변화에 대한 연구를 용이하게합니다.
Abstract
소리의 변환은 대사적으로 까다로우며, 측벽에 있는 미세혈관구조의 정상적인 기능은 내달팽이관 전위, 이온 수송 및 체액 균형을 유지하는 데 중요합니다. 다양한 형태의 청력 장애가 달팽이관의 비정상적인 미세 순환을 수반하는 것으로 보고됩니다. 달팽이관 혈류(CoBF) 병리가 청력 기능에 미치는 영향에 대한 조사는 실현 가능한 심문 방법이 부족하고 내이에 접근하기 어렵기 때문에 어렵습니다. 형광 생체 내 현미경과 결합 된 측면 달팽이관 벽의 열린 혈관 창은 생체 내에서 CoBF 변화를 연구하는 데 사용되었지만 대부분 기니피그에서, 최근에야 마우스에서 사용되었습니다. 이 논문과 관련 비디오는 마우스 달팽이관의 혈류를 시각화하기위한 열린 혈관 창 방법을 설명합니다. 상세는 1) 마우스로부터 형광 표지된 혈구 현탁액의 제조; 2) 마취된 마우스에서 생체내 현미경 검사를 위한 개방 혈관 창의 구성, 및 3) 영상의 오프라인 기록을 이용한 혈류 속도 및 부피의 측정. 이 방법은 정상 및 병리학적 조건에서 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 조사하기 위해 마우스에서 열린 창 접근 방식을 사용하는 방법을 보여주기 위해 비디오 형식으로 제공됩니다.
Introduction
외측 달팽이관 벽의 미세 순환의 정상적인 기능(나선형 인대 및 선조체 혈관에 있는 모세혈관의 대부분을 구성)은청력 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다1. 비정상적인 CoBF는 소음 유발성 난청, 귀 수종 및 노안 2,3,4,5,6,7,8,9를 포함한 많은 내이 장애의 병태생리학과 관련이 있습니다. 생체 내 CoBF의 시각화는 청력 기능과 달팽이관 혈관 병리 사이의 연관성을 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다.
측두골 내 달팽이관의 복잡성과 위치로 인해 CoBF의 직접적인 시각화 및 측정이 불가능하지만 레이저 도플러 유량 측정(LDF)10,11,12, 자기 공명 영상(MRI)13, 형광 생체 내 현미경(FIVM)14, 형광 미세 내시경(FME)15, 내시경 레이저 스페클 대비 이미징(LSCI)16을 포함한 다양한 방법이 CoBF 평가를 위해 개발되었습니다. , 표지 된 마커 및 방사성 태그 된 마이크로 스피어를 혈류에 주입하는 접근법 (광학 미세 혈관 조영술, OMAG) 17,18,19,20. 그러나 이러한 방법 중 어느 것도 FIVM을 제외하고 생체 내 CoBF의 변화를 절대적으로 실시간으로 추적할 수 없었습니다. FIVM은 측면 달팽이관 벽의 혈관 창과 결합하여 다양한 실험실 14,21,22에 의해 다양한 실험 조건 하에서 기니피그에서 사용되고 검증 된 접근법입니다.
형광 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란을 조영제로 사용하고 형광 염료(DiO(3′-디옥타데실록사카르보시아닌 과염소산염, 녹색) 또는 딜(1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염, 빨간색)을 사용하여 마우스의 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 연구하기 위한 FIVM 방법이 성공적으로 확립되었습니다. 본 연구에서이 방법의 프로토콜은 정상 및 병리학 적 상태 (예 : 소음 노출 후)에서 마우스의 CoBF 변화를 이미징하고 정량화하기 위해 설명되었습니다. 이 기술은 연구자에게 특히 쉽게 사용할 수있는 형질 전환 마우스 모델과 함께 적용 할 때 선조체 혈관의 청력 기능 장애 및 병리와 관련된 CoBF의 기본 메커니즘을 조사하는 데 필요한 도구를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 마우스 모델의 달팽이관 측벽(및 선조체 혈관)에 있는 모세혈관이 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창 준비에서 형광단 라벨링으로 시각화될 수 있는 방법을 보여줍니다. 마우스 모델은 널리 사용되고 인간의 건강 및 질병을 조사하기 위한 포유동물 모델로서 선호된다. 여기에 설명된 프로토콜은 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창을 사용하여 마우스 측벽(특히 선조체 혈관에서)에서 CoBF를 이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) 및 Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi)의 Medical Research Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
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