Mätning av steget blodflöde i mussnäcka med hjälp av ett öppet kärlfönster och intravital fluorescensmikroskopi
Summary
En öppen kärlfönstermetod med fluorescerande spårämnen ger tillräcklig upplösning för mätning av cochleärt blodflöde (CoBF). Metoden underlättar studien av strukturella och funktionella förändringar i CoBF i mus under normala och patologiska förhållanden.
Abstract
Transduktion av ljud är metaboliskt krävande, och mikrovaskulaturens normala funktion i sidoväggen är avgörande för att upprätthålla endokochleär potential, jontransport och vätskebalans. Olika former av hörselskador rapporteras involvera onormal mikrocirkulation i snäckan. Undersökning av hur cochleärt blodflöde (CoBF) patologi påverkar hörselfunktionen är utmanande på grund av bristen på genomförbara förhörsmetoder och svårigheten att komma åt innerörat. Ett öppet kärlfönster i den laterala cochleaväggen, i kombination med fluorescens intravital mikroskopi, har använts för att studera CoBF-förändringar in vivo, men mestadels hos marsvin och först nyligen i musen. Detta papper och tillhörande video beskriver den öppna kärl-fönstermetoden för att visualisera blodflödet i mussnäckan. Detaljer inkluderar 1) beredning av den fluorescerande märkta blodcellssuspensionen från möss; 2) konstruktion av ett öppet kärlfönster för intravital mikroskopi i en bedövad mus, och 3) mätning av blodflödeshastighet och volym med hjälp av en offline-inspelning av avbildningen. Metoden presenteras i videoformat för att visa hur man kan använda öppna fönstermetoden i mus för att undersöka strukturella och funktionella förändringar i den cochleära mikrocirkulationen under normala och patologiska förhållanden.
Introduction
Mikrocirkulationens normala funktion i den laterala cochleaväggen (som omfattar majoriteten av kapillärerna i spiralbandet och stria vascularis) är kritiskt viktigt för att upprätthålla hörselfunktionen1. Onormal CoBF är inblandad i patofysiologin hos många inre öronsjukdomar inklusive bullerinducerad hörselnedsättning, öronhydrops och presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering av intravital CoBF kommer att möjliggöra en bättre förståelse av kopplingarna mellan hörselfunktion och cochleär vaskulär patologi.
Även om komplexiteten och placeringen av snäckan i det temporala benet utesluter direkt visualisering och mätning av CoBF, har olika metoder utvecklats för bedömning av CoBF inklusive laser-dopplerflödesmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonanstomografi (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroskopi (FME)15, endoskopisk laserspektledkontrastavbildning (LSCI)16 och metoder baserade på injektion av märkta markörer och radioaktivt märkta mikrosfärer i blodomloppet (optisk mikroangografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen av dessa metoder har dock möjliggjort absolut realtidsspårning av förändringar i CoBF in vivo, med undantag för FIVM. FIVM, i kombination med ett kärlfönster i den laterala cochleaväggen, är ett tillvägagångssätt som har använts och validerats hos marsvin under olika experimentella förhållanden av olika laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metod etablerades framgångsrikt för att studera de strukturella och funktionella förändringarna i den cochleära mikrocirkulationen hos mus med hjälp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-dextran som kontrastmedium och fluorescensfärgämne – antingen DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyaninperklorat, grönt) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetrametylindokarbocyaninperklorat, rött)-för förmärkning av blodkroppar, visualisering av kärl och spårning av blodflödeshastighet. I denna studie har protokollet för denna metod beskrivits för avbildning och kvantifiering av förändringar i CoBF hos mus under normala och patologiska förhållanden (t.ex. efter bullerexponering). Denna teknik ger forskaren de verktyg som behövs för att undersöka de underliggande mekanismerna för CoBF relaterade till hörseldysfunktion och patologi i stria vascularis, särskilt när de appliceras tillsammans med lättillgängliga transgena musmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna uppsats visar hur kapillärer i den cochleära sidoväggen (och i stria vascularis) i en musmodell kan visualiseras med fluoroformärkning i ett öppet kärlfönsterberedning under ett FIVM-system. Musmodell används ofta och föredras som en däggdjursmodell för att undersöka människors hälsa och sjukdom. Protokollet som beskrivs här är ett genomförbart tillvägagångssätt för avbildning och undersökning av CoBF i musens sidovägg (särskilt i stria vascularis) med hjälp av ett öppet kärlfönster unde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) och Medical Research Foundation från Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
