טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי ללא לייזר לביצוע ניתוח מבני מסדר גבוה יותר של חלבונים
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה לשימוש בדוסימטריה רדיקלית מוטבעת ומקור אור פלזמה לביצוע טביעת רגל של חלבון חמצון פלאש. שיטה זו מחליפה את לייזר UV מסוכן כדי לפשט ולשפר את הרבייה של חמצון פוטוכימי מהיר של מחקרי חלבון.
Abstract
טביעת רגל של חלבון רדיקלי הידרוקסיל (HRPF) היא טכניקת ניתוח מבנית מתפתחת ומבטיחה מסדר גבוה יותר המספקת מידע על שינויים במבנה החלבון, אינטראקציות בין חלבונים לחלבון או אינטראקציות בין חלבונים. HRPF משתמש ברדיקלים הידרוקסיל(▪OH) כדי לתייג באופן בלתי הפיך משטח נגיש ממס של חלבון. המורכבות, העלות והאופי המסוכן הטמון בביצוע HRPF הגבילו באופן משמעותי את האימוץ הנרחב בביופארמה. גורמים אלה כוללים: 1) שימוש בלייזרים מורכבים, מסוכנים ויקרים הדורשים אמצעי זהירות משמעותיים; ו -2) חוסר ההתאמה של HRPF שנגרם על ידי ניקוי רקע של ▪OH המגבילים מחקרים השוואתיים. פרסום זה מספק פרוטוקול להפעלת מערכת HRPF נטולת לייזר. מערכת HRPF נטולת לייזר זו משתמשת בטכנולוגיית חמצון הבזק מקור פלזמה באנרגיה גבוהה ובלחץ גבוה עם דוזימטריה רדיקלית בשורה. מקור אור הפלזמה בטוח יותר, קל יותר לשימוש ויעיל יותר ביצירת רדיקלים הידרוקסיל מאשר מערכות HRPF מבוססות לייזר, והדוסימטר הרדיקלי בשורה מגביר את הרבייה של מחקרים. בשילוב, מערכת HRPF נטולת הלייזר מטפלת ומתגברת על החסרונות והמגבלות שהוזכרו בטכניקות מבוססות לייזר.
Introduction
קונפורמציה של חלבונים ומבנה מסדר גבוה יותר (HOS) הם הקובעים העיקריים של תפקוד ביולוגי תקין והתנהגות חריגה1. כנ”ל לגבי biopharmaceuticals, אשר מבנה ופעילות תפקודית תלויה בהיבטים שונים של הייצור והסביבה שלהם. שינוי Biopharmaceutical ב HOS קושרו תופעות לוואי (ADR) המיוחסים פרמקולוגיה לא רצויה תגובה אימונולוגית המטופל2,3. המראה של ADRs התריע על התעשייה הביופארמה לתפקיד הקריטי כי חלבון HOS ממלא הבטיחות והיעילות של biotherapeutics, והם הקימו את הצורך ניתוח HOS חדש ומשופר4.
טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי (HRPF) היא טכניקה מבטיחה למעקב אחר השינוי בחלבון HOS. HRPF כרוך תיוג בלתי הפיך של החיצוני של חלבון עם ▪OH ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) כדי לזהות את פני השטח נגיש ממס של החלבון5,6,7. HRPF שימש בהצלחה לגילוי פגמים בחלבון HOS ותפקודו8,9, לאפיין את HOS של נוגדנים חד שבטיים (mAb)10,11,12,13, לקבוע את Kd מחייב של ליגנד14, ועוד הרבה יותר15,16,17,18,19. שיטה נפוצה ליצירת ▪OH עבור HRPF היא חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP), אשר משתמשת בלייזר UV מהיר ואנרגיה גבוהה כדי לייצר ▪OH מפוטוליזה של H2O2. על פי רוב, FPOP משתמש לייזרים excimer יקר העסקת גז מסוכן (KrF) הדורש אמצעי הגנה משמעותיים כדי למנוע פגיעה בדרכי הנשימה והעין20. כדי למנוע סכנות שאיפה, אחרים השתמשו בתדר מרובע ניאודימיום yttrium אלומיניום גארנט (Nd:YAG) לייזרים21, אשר מבטל את השימוש בגז רעיל אבל הם עדיין יקרים, דורשים מומחיות מבצעית משמעותית, ודורשים בקרות אור תועה נרחב כדי להגן על המשתמשים מפני פגיעה בעין.
למרות שניתן להשיג מידע רב באמצעות HRPF, אימוץ נרחב בביופארמה לא נענה. שני חסמים לאימוץ מוגבל HRPF כוללים: 1) שימוש בלייזרים מסוכנים ויקרים הדורשים אמצעי זהירות משמעותיים20; ו -2) חוסר ההתאמה של HRPF שנגרם על ידי ניקוי רקע של ▪OH המגבילים מחקרים השוואתיים22. כדי להחליף את השימוש בלייזר, במהירות גבוהה, אנרגיה גבוהה פלזמה פלאש פוטוליזה היחידה פותחה כדי לבצע בבטחה FPOP באופן קל. כדי לשפר את חוסר ההתאמה של ניסויי HRPF, דוסימטריה רדיקלית בזמן אמת מיושמת.
הנוהג של HRPF הוגבל על ידי חוסר תאימות המיוחס ניקוי רקע של ▪OH22. בעוד ▪OH הם בדיקות מצוינות של טופוגרפיה חלבון, הם גם מגיבים עם מרכיבים רבים שנמצאו בהכנות, מה שהופך אותו הכרחי כדי למדוד את הריכוז היעיל של רדיקלים זמינים כדי לחמצן חלבון היעד. וריאציות בהכנת חיץ, ריכוז מי חמצן, תכונות ליגנד, או פוטוליזה יכול לגרום הבדלי חמצון בין קבוצות בקרה וניסוי שיוצרים עמימות במחקרים דיפרנציאליים HOS. התוספת של דוזימטריה רדיקלית בזמן אמת מאפשרת התאמה של ההשפעה ▪עומס OH ולכן מגבירה את הביטחון והשחזור במהלך ניסוי HRPF. השימוש בדוזימטריה רדיקלית ב- FPOP תואר במקום אחר23,24,25, והוא נדון בפירוט בפרסום האחרון26. כאן, אנו מתארים את השימוש במערכת פוטוליזה פלאש רומן ודוזימטריה בזמן אמת כדי לתייג אפו-מיוגלובין סוסים (aMb), השוואת רמות של חמצון פפטיד בניסוי FPOP לזה של המתקבל בעת שימוש בלייזר excimer.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח תיוג נכון של חלבונים במהלך כל ניסוי HRPF. ראשית, קצב זרימה מתאים וקצב הבזק מקור נבחרים כדי לוודא שכל בולוס של המדגם מוקרן פעם אחת. זה מבטיח כי החלבון נחשף בולוס יחיד של ▪החדש שנוצר OH. לאחר חמצון החלבון, ניתן לשנות את מבנה החלבון מסדר גבוה יותר. כדי להיות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (R43GM125420 ו R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
- Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
- Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
- Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
- Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. 생화학. 44 (9), 3166-3175 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
- Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
- Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
- Linde. . Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
- Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
- Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
- Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
- Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
- Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
- Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
- Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
- Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
- Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
- Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).
