Denne protokol præsenterer en metode til at bruge inline radikal dosimetri og en plasmalyskilde til at udføre flash oxidationsproteinfodaftryk. Denne metode erstatter den farlige UV-laser for at forenkle og forbedre reproducerbarheden af hurtig fotokemisk oxidation af proteinundersøgelser.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en ny og lovende strukturanalyseteknik med højere orden, der giver information om ændringer i proteinstruktur, proteinproteininteraktioner eller protein-ligand-interaktioner. HRPF udnytter hydroxylradikaler (▪OH) til uigenkaldeligt at mærke et proteins opløsningsmiddeltilgængelige overflade. Den iboende kompleksitet, omkostninger og farlige karakter af at udføre HRPF har i væsentlig grad begrænset bredt funderet anvendelse i biopharma. Disse faktorer omfatter: 1) brugen af komplicerede, farlige og dyre lasere, der kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger; og 2) den irreproducibility af HRPF forårsaget af baggrund scavenging af ▪OH, der begrænser sammenlignende undersøgelser. Denne publikation indeholder en protokol til drift af et laserfrit HRPF-system. Dette laserfri HRPF-system anvender en højenergi, højtryksplasmalyskilde flash oxidationsteknologi med in-line radikal dosimetri. Plasmalyskilden er sikrere, lettere at bruge og mere effektiv til at generere hydroxylradikaler end laserbaserede HRPF-systemer, og det in-line radikale dosimeter øger reproducerbarheden af undersøgelser. Tilsammen adresserer og overvinder det laserfri HRPF-system de nævnte mangler og begrænsninger ved laserbaserede teknikker.
Proteinformation og tilhørende højere ordensstruktur (HOS) er de vigtigste determinanter for korrekt biologisk funktion og afvigende adfærd1. Det samme gælder for biofarmaceutiske lægemidler, hvis struktur og funktionelle aktivitet er afhængig af forskellige aspekter af deres produktion og miljø. Biofarmaceutiske ændringer i HOS har været forbundet med bivirkninger (ADR), der tilskrives uønsket farmakologi og patientens immunologiskerespons 2,3. Udseendet af BIVIRKNINGER har advaret den biofarmaceutiske industri om den kritiske rolle, som protein HOS spiller i sikkerheden og effekten af bioterapeutiske lægemidler, og de har fastslået behovet for nye og forbedrede HOS-analyser4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en lovende teknik til at spore ændringen i protein HOS. HRPF indebærer uoprettelig mærkning af et proteins ydre med ▪OH efterfulgt af ms-analyse (mass spektrometri) til identifikation af proteinets opløsningsmiddeltilgængelige overflade5,6,7. HRPF er med succes blevet brugt til at opdage defekter i protein HOS og dets funktion8,9, karakteriserer HOS af monoklonale antistoffer (mAb)10,11,12,13, bestemme binding Kd af en ligand14, og meget mere15,16,17,18,19. En almindelig metode til at generere ▪OH for HRPF er Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), som anvender højenergi, hurtige UV-lasere til at producere ▪OH fra fotolyse af H2O2. FPOP anvender for det meste dyre excimerlasere, der anvender farlig gas (KrF), som kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger for at undgå åndedræts- og øjenskader20. For at undgå indånding farer, andre har brugt frekvens firedoblet neodymium yttrium aluminium granat (Nd:YAG) lasere21, som eliminerer brugen af giftige gas, men er stadig dyrt, kræver betydelig operationel ekspertise, og kræver omfattende omstrejfende lys kontrol for at beskytte brugerne mod øjenskader.
Selv om der kan indhentes rigelige oplysninger ved hjælp af HRPF, er bred anvendelse i biopharma ikke blevet opfyldt. To hindringer for den begrænsede HRPF-vedtagelse omfatter: 1) anvendelse af farlige og dyre lasere, der kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger20; og 2) hrpf’s irreproducibilitet som følge af baggrundsudledning af ▪OH, der begrænser sammenlignende undersøgelser22. Til supplant laser brug, en høj hastighed, høj energi plasma flash fotolyse enhed blev udviklet til sikkert at udføre FPOP på en letkøbt måde. For at forbedre irreproducibility af HRPF eksperimenter, real-time radikal dosimetri er gennemført.
Hrpf’s praksis har været begrænset af irreproducibility, der tilskrives baggrundsudledning af ▪OH22. Mens ▪OH er fremragende sonder af proteintopografi, reagerer de også med mange bestanddele, der findes i præparater, hvilket gør det nødvendigt at måle den effektive koncentration af radikal, der er tilgængelig for at oxidere et målprotein. Variationer i bufferpræparat, hydrogenperoxidkoncentration, ligandegenskaber eller fotolyse kan resultere i oxidationsforskelle mellem kontrol- og eksperimentelle grupper, der skaber tvetydighed i HOS-differentialundersøgelser. Tilføjelsen af radikal dosimetri i realtid gør det muligt at justere effekten ▪OH-belastning og øger derfor tilliden og reproducerbarheden under et HRPF-eksperiment. Brugen af radikal dosimetri i FPOP er beskrevet andetsteds23,24,25og diskuteres yderligere i detaljer i en nylig publikation26. Her beskriver vi brugen af en ny flash fotolyse system og real-time dosimetri til mærkning heste apo-myoglobin (aMb), sammenligne niveauer af peptid oxidation i en FPOP eksperiment til den opnåede, når du bruger en excimer laser.
Der er flere kritiske trin for at sikre korrekt mærkning af proteiner under ethvert HRPF-eksperiment. For det første vælges en passende strømningshastighed og kilde flash rate for at sikre, at hver bolus af prøven bestråles én gang. Dette sikrer, at proteinet udsættes for en enkelt bolus af nydannede ▪OH. Når et protein er oxideret, kan den højere orden proteinstruktur ændres. For at være sikker på, at den oprindelige proteinstruktur undersøges, skal hvert proteinmolekyle ændres på et enkelt …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 og R44GM125420).
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
UPLC | Thermo Scientific | ||
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |