Laserfri hydroksylradikale proteinfotavtrykk for å utføre strukturell analyse av proteiner med høyere orden

Summary

Denne protokollen presenterer en metode for å bruke inline radikal dosimetri og en plasma lyskilde for å utføre flash oksidasjon protein fotavtrykk. Denne metoden erstatter den farlige UV-laseren for å forenkle og forbedre reproduserbarheten av rask fotokjemisk oksidasjon av proteinstudier.

Abstract

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en fremvoksende og lovende strukturell analyseteknikk med høyere rekkefølge som gir informasjon om endringer i proteinstruktur, proteinproteininteraksjoner eller proteinligandinteraksjoner. HRPF bruker hydroksylradikaler^(▪OH) til å irreversibelt merke et proteins løsningsmiddel tilgjengelige overflate. Den iboende kompleksiteten, kostnaden og den farlige karakteren av å utføre HRPF har vesentlig begrenset bred adopsjon i biofarma. Disse faktorene inkluderer: 1) bruk av kompliserte, farlige og dyre lasere som krever betydelige sikkerhetsforanstaltninger; og 2) irreproducibility av HRPF forårsaket av bakgrunn scavenging av ^▪OH som begrenser komparative studier. Denne publikasjonen inneholder en protokoll for drift av et laserfritt HRPF-system. Dette laserfrie HRPF-systemet bruker en høyenergi plasmalyskilde for høytrykksblits oksidasjonsteknologi med in-line radikal dosimetri. Plasmalyskilden er tryggere, enklere å bruke og mer effektiv i å generere hydroksylradikaler enn laserbaserte HRPF-systemer, og det in-line radikale dosimeteret øker reproduserbarheten av studier. Kombinert adresserer og overgår det laserfrie HRPF-systemet de nevnte manglene og begrensningene ved laserbaserte teknikker.

Introduction

Proteinkonformasjon og tilhørende høyere ordensstruktur (HOS) er de viktigste determinantene for riktig biologisk funksjon og avvikende oppførsel¹. Det samme gjelder biofarmasøytiske stoffer, hvis struktur og funksjonelle aktivitet er avhengig av ulike aspekter av produksjon og miljø. Biofarmasøytisk endring i HOS har vært knyttet til bivirkninger (ADR) som tilskrives uønsket farmakologi og pasientens immunologiske respons^2,3. Utseendet til BIVIRKNINGER har varslet den biofarmasøytiske industrien om den kritiske rollen som protein HOS spiller i sikkerhet og effekt av bioterapeutikk, og de har etablert behovet for ny og forbedret HOS-analyse⁴.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en lovende teknikk for å spore endringen i protein HOS. HRPF innebærer irreversibel merking av et proteins eksteriør med ^▪OH etterfulgt av massespektrometri (MS) analyse for å identifisere den løsningsmiddeltilgjengelige overflaten av proteinet^5,6,7. HRPF har med hell blitt brukt til å oppdage defekter i protein HOS og dens funksjon^8,9, karakteriserer HOS av monoklonale antistoffer (mAb)^10,11,12,13, bestemme bindingen Kd av en ligand¹⁴, og mye mer^{15,16,17,18,19}. En vanlig metode for å generere ^▪OH for HRPF er Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP), som bruker høyenergiske, raske UV-lasere for å produsere ^▪OH fra fotolyse av H₂O₂. For det meste bruker FPOP dyre ekssitasjonslasere som bruker farlig gass (KrF) som krever betydelige sikkerhetstiltak for å unngå åndedretts- og øyeskader²⁰. For å unngå innåndingsfarer har andre brukt frekvens firedoblet neodymium yttrium aluminiumspynt (Nd:YAG) lasere²¹, som eliminerer bruken av giftig gass, men som fortsatt er kostbare, krever betydelig driftskompetanse og krever omfattende bortkomne lyskontroller for å beskytte brukere mot øyeskader.

Selv om rikelig med informasjon kan innhentes ved hjelp av HRPF, er bred adopsjon i biofarma ikke oppfylt. To barrierer for begrenset HRPF-adopsjon inkluderer: 1) bruk av farlige og dyre lasere som krever betydelige sikkerhetsforanstaltninger²⁰; og 2) irreproducibility av HRPF forårsaket av bakgrunn scavenging av ^▪OH som begrenser komparative studier²². For å erstatte laserbruk ble en høyhastighets plasmablitsfotolyseenhet med høy energi utviklet for å utføre FPOP på en facile måte. For å forbedre irreproducibility av HRPF eksperimenter, sanntid radikal dosimetri er implementert.

Praktiseringen av HRPF har vært begrenset av irreproducibility tilskrives bakgrunnsoppfinnelse av ^▪OH²². Mens ^▪OH er gode sonder av proteintopografi, reagerer de også med mange bestanddeler som finnes i preparater, noe som gjør det nødvendig å måle den effektive konsentrasjonen av radikal tilgjengelig for å oksidere et målprotein. Variasjoner i bufferforberedelse, hydrogenperoksidkonsentrasjon, ligandegenskaper eller fotolyse kan føre til oksidasjonsforskjeller mellom kontroll og eksperimentelle grupper som skaper tvetydighet i HOS-differensialstudier. Tillegg av sanntids radikal dosimetri muliggjør justering av effekten ^▪OH-belastning og øker derfor tilliten og reproduserbarheten under et HRPF-eksperiment. Bruk av radikal dosimetri i FPOP er beskrevet andre steder^23,24,25, og diskuteres nærmere i en nylig publikasjon²⁶. Her beskriver vi bruken av et nytt flash fotolysesystem og sanntids dosimetri for å merke hesteapinoglobin (aMb), og sammenligne nivåer av peptidoksidasjon i et FPOP-eksperiment med det som oppnås ved bruk av en excimer laser.

Protocol

1. Montering av kapillærrøret Ved hjelp av en silikaklyngestein, cleave 250 μm indre diameter (ID) silika kapillær til 27 tommer. Kontroller kapillærendene for et rent, rett snitt. Lag to vinduer omtrent 15 mm lange ved å brenne bort polyimidbelegget. Fra den “nedre enden” gjør du det første fotolysevinduet 90 mm fra den “nedre enden” og det andre dosimetervinduet 225 mm fra den “nedre enden”.MERK: Når belegget er brent bort, er kapillæren svært skjør. Skru av mutteren og fer…

Representative Results

Høytrykks plasmakilden kombinert med sanntidsdosimetri gir bedre kontroll over ▪OH-utbytte for å observere endringer i høyere ordens proteinstruktur mer nøyaktig. Tilsetningen av adenin gir mulighet for et effektivt radikalt dosimeter i sanntid. Ved oksidasjon mister adenin UV-absorbans ved 265 nm (Figur 2A). Endringen i adeninabsorbering er direkte relatert til konsentrasjonen av radikalere som er tilgjengelige for HRPF, og gir dermed et middel til effektivt å overvåke en…

Discussion

Det er flere kritiske trinn for å sikre riktig merking av proteiner under et HRPF-eksperiment. For det første velges en passende strømningshastighet og kildeblitshastighet for å sikre at hver bolus av prøven bestråles en gang. Dette sikrer at proteinet blir utsatt for en enkelt bolus av nydannede ^▪OH. Når et protein er oksidert, kan proteinstrukturen med høyere rekkefølge endres. For å være trygg på at den opprinnelige proteinstrukturen er undersøkt, må hvert proteinmolekyl endres på et enkelt…

Materials

15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A	any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes	Fisher Scientific	SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm)	Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS120-500
Apomyoglobin	Sigma-Aldrich
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Centrifuge	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide	Chem-Impex	03109
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32”	Molex	1068680064	any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC	Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS118-500
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	W6-4