Laserfri HydroxylRadikalt proteinavtryck för att utföra högre ordning strukturell analys av proteiner
Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att använda inline radikal dosimetri och en plasma ljuskälla för att utföra flash oxidation protein fotavtryck. Denna metod ersätter den farliga UV-lasern för att förenkla och förbättra reproducerbarheten av snabb fotokemisk oxidation av proteinstudier.
Abstract
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) är en framväxande och lovande strukturanalysteknik med högre ordning som ger information om förändringar i proteinstruktur, proteinproteininteraktioner eller protein-ligand interaktioner. HRPF använder hydroxylradikaler(▪OH) för att oåterkalleligen märka ett proteins lösningsmedelskomgängliga yta. Den inneboende komplexiteten, kostnaden och den farliga karaktären hos att utföra HRPF har avsevärt begränsat bredbaserad användning i biopharma. Dessa faktorer inkluderar: 1) användning av komplicerade, farliga och dyra lasrar som kräver betydande säkerhetsåtgärder; och 2) hrpf:s omöjlighet till följd av bakgrundsrensning av ▪OH som begränsar jämförande studier. Denna publikation ger ett protokoll för drift av ett laserfritt HRPF-system. Detta laserfria HRPF-system använder en högenergi, högtrycks plasma ljuskälla flash oxidation teknik med in-line radikal dosimetri. Plasmaljuskällan är säkrare, lättare att använda och effektivare när det gäller att generera hydroxylradikaler än laserbaserade HRPF-system, och den in-line radikala dosimetern ökar reproducerbarheten av studier. Tillsammans adresserar och övervinner det laserfria HRPF-systemet de nämnda bristerna och begränsningarna i laserbaserade tekniker.
Introduction
Proteinkonformation och tillhörande högre orderstruktur (HOS) är de viktigaste bestämningsfaktorerna för korrekt biologisk funktion och avvikande beteende1. Detsamma gäller biofarmaceutiska läkemedel, vars struktur och funktionella aktivitet är beroende av olika aspekter av deras produktion och miljö. Biofarmaceutiska förändringar i HOS har kopplats till biverkningar (ADR) som tillskrivs oönskad farmakologi och patientens immunologiskasvar 2,3. Utseendet på ADR har varnat den biofarmaceutiska industrin för den kritiska roll som protein HOS spelar för säkerheten och effektiviteten hos bioterapeuter, och de har fastställt behovet av ny och förbättrad HOS-analys4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) är en lovande teknik för att spåra förändringen i protein HOS. HRPF innebär irreversibel märkning av ett proteins exteriör med ▪OH följt av masspektrometri (MS) analys för att identifiera proteinets lösningsmedelsåliga yta5,6,7. HRPF har framgångsrikt använts för att upptäcka defekter i protein HOS och dessfunktion 8,9, karakterisera HOS av monoklonala antikroppar (mAb)10,11,12,13, bestämma bindningen Kd av en ligand14, och mycket mer15,16,17,18,19. En vanlig metod för att generera ▪OH för HRPF är Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), som använder högenergiska, snabba UV-lasrar för att producera ▪OH från fotolys av H2O2. För det mesta använder FPOP dyra excimerlasrar som använder farlig gas (KrF) som kräver betydande skyddsåtgärder för att undvika andnings- och ögonskada20. För att undvika inandningsrisker har andra använt frekvensdubbelt neodym yttrium aluminium granat (Nd:YAG) lasrar21, vilket eliminerar användningen av giftig gas men fortfarande är kostsamma, kräver betydande operativ expertis och kräver omfattande herrelösa ljuskontroller för att skydda användare från ögonskada.
Även om riklig information kan erhållas med HRPF, har bred adoption i biopharma inte uppfyllts. Två hinder för det begränsade antagandet av hrpf omfattar: 1) användning av farliga och dyra lasrar som kräver betydande säkerhetsåtgärder20; och 2) Hrpf:s omöjlighet till följd av bakgrundsrensning av ▪OH som begränsar jämförande studier22. För att ersätta laseranvändning utvecklades en höghastighets, högenergi plasma flash fotolysenhet för att säkert utföra FPOP på ett enkelt sätt. För att förbättra okrmotståndligheten hos HRPF-experiment implementeras radikal dosimetri i realtid.
Hrpf-metoden har begränsats av irreproduktivitet som tillskrivs bakgrundsrensning av ▪OH22. Medan ▪OH är utmärkta sonder av proteintopografi, reagerar de också med många beståndsdelar som finns i preparat, vilket gör det nödvändigt att mäta den effektiva koncentrationen av radikaler som finns tillgängliga för att oxidera ett målprotein. Variationer i buffertberedning, väteperoxidkoncentration, ligandegenskaper eller fotolys kan resultera i oxidationsskillnader mellan kontroll- och experimentgrupper som skapar tvetydighet i HOS-differentierade studier. Tillägget av radikal dosimetri i realtid möjliggör justering av effekten ▪OH-belastning och ökar därför förtroendet och reproducerbarheten under ett HRPF-experiment. Användningen av radikal dosimetri i FPOP har beskrivits någon annanstans23,24,25, och diskuteras vidare i detalj i en ny publikation26. Här beskriver vi användningen av ett nytt flash fotolyssystem och dosimetri i realtid för att märka hästapo-myoglobin (aMb), jämföra nivåer av peptidoxidation i ett FPOP-experiment med det som erhålls vid användning av en excimerlaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera kritiska steg för att säkerställa korrekt märkning av proteiner under alla HRPF-experiment. För det första väljs ett lämpligt flöde och källblixthastighet för att säkerställa att varje bolus i provet bestrålas en gång. Detta säkerställer att proteinet utsätts för en enda bolus av nybildad ▪OH. När ett protein oxideras kan proteinstrukturen i högre ordning ändras. För att vara säker på att den inhemska proteinstrukturen undersöks måste varje proteinmolekyl modifieras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 och R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
- Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
- Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
- Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
- Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. 생화학. 44 (9), 3166-3175 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
- Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
- Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
- Linde. . Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
- Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
- Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
- Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
- Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
- Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
- Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
- Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
- Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
- Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
- Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).
