Настоящий протокол описывает методы исследования структуры и динамики двух модельных белков, которые играют важную роль в здоровье человека. Метод сочетает в себе настольную биофизическую характеристику с нейтронной спиновой эхо-спектроскопией для доступа к динамике во временных и длинных масштабах, имеющих отношение к междоменным движениям белка.
Активность и функциональность большинства белков человеческого организма связаны с конфигурационными изменениями целых поддоменов в кристаллической структуре белка. Кристаллические структуры создают основу для любого расчета, который описывает структуру или динамику белка, в большинстве случаев с сильными геометрическими ограничениями. Однако эти ограничения от кристаллической структуры отсутствуют в растворе. Структура белков в растворе может отличаться от кристаллической из-за перестановок петель или поддоменов на шкале времени пико к наносекунде (т.е. временному режиму внутренней динамики белка). Настоящая работа описывает, как медленные движения на временных масштабах в несколько десятков наносекунд могут быть доступны с помощью рассеяния нейтронов. В частности, динамическая характеристика двух основных человеческих белков, внутренне неупорядоченного белка, который не имеет четко определенной вторичной структуры и классического белка антитела, решается с помощью нейтронной спиновой эхо-спектроскопии (NSE) в сочетании с широким спектром лабораторных методов характеристики. Дальнейшее понимание динамики белкового домена было достигнуто с использованием математического моделирования для описания экспериментальных данных нейтронов и определения пересечения между комбинированными диффузными и внутренними движениями белка. Извлечение внутреннего динамического вклада в промежуточную функцию рассеяния, полученного из NSE, включая временную шкалу различных движений, позволяет дополнительно увидеть механические свойства отдельных белков и мягкость белков в их почти естественной среде в переполненном белковом растворе.
Зондирующая динамика мягкого вещества с нейтронами
Исследование динамических свойств белков и пептидов является важной частью биофизических исследований, и сегодня существует множество хорошо разработанных методов для доступа к широкому спектру энергетических ландшафтов1. Соотнесение экспериментально выявленной динамики белков с их биологической функцией является гораздо более сложной задачей, требующей сложных математических моделей и компьютерного моделирования динамики. Важность нейтронной спектроскопии для анализа движений белка была подчеркнута в нескольких хорошо принятых и широко признанных исследованиях 1,2,3,4,5. Прежде чем исследовать разнообразный энергетический ландшафт внутренней динамики белка, требуется краткий обзор динамических процессов в мягкой материи и того, как нейтроны могут получить к ним доступ.
Чувствительность нейтронов к изотопной конфигурации и тип взаимодействий, которые они проявляют с мягким веществом, делает рассеяние нейтронов одним из наиболее универсальных методов исследования6. Существует широкий спектр шкал длин корреляции и времени корреляции, к которым могут получить доступ нейтроны, от ядерных возбуждений и атомных колебаний до коллективных движений и медленных процессов релаксации, таких как изотропные вращения и диффузионные движения. При исследовании рассеянных нейтронов на предмет их переноса энергии можно выделить три основных взаимодействия: упругое рассеяние, при котором отсутствует энергообмен между входящим нейтроном и частицей в образце; неупругое рассеяние с большим, поддающимся количественной оценке энергетическим обменом между нейтроном и частицей; и своеобразный случай квазиупругого рассеяния, обозначающий очень малый перенос энергии по сравнению с падающей энергией нейтронов 1,7. Эти взаимодействия дают точную информацию об исследуемом материале и составляют теоретическую основу широкого спектра методов рассеяния нейтронов.
При упругом рассеянии детектор записывает направления нейтронов как дифракционную картину, которая показывает положение атомов образца относительно друг друга. Получена информация о корреляциях атомных положений (т.е. интегральная интенсивность S(Q) относительно переноса импульса Q, относящаяся только к структурной информации). Этот принцип лежит в основе дифракции нейтронов8.
Сложность возникает, когда передача энергии больше не равна нулю из-за возбуждений и внутренних флуктуаций в материале образца. Это составляет основу нейтронной спектроскопии, в которой рассеянные нейтроны исследуются как функция как переноса энергии E , так и переноса импульса Q. Получена динамическая и структурная информация. Нейтронная спектроскопия измеряет одинаковую интегральную интенсивность S(Q) для передачи энергии (т.е. изменение скорости нейтронов из-за рассеяния образцов, S(Q,ω) = S(Q, E), что также называется коэффициентом динамической структуры)9.
Для расчета рассеяния из материала более адекватно использовать парную корреляционную функцию 7,10. В дифракционном случае статическая парная корреляционная функция G(r) дает вероятность нахождения центра частицы на заданном расстоянии r от центра другой частицы. Спектроскопия обобщает статическую парную корреляционную функцию и включает энергию/частоту/время в уравнение рассеяния. Парная корреляционная функция G(r) становится функцией времени G(r, t), которая может быть разложена на отдельную корреляционную функцию пары атомов GD(r, t) и самокорреляционную функцию GS(r, t). Они описывают два типа корреляций: парно-коррелированные движения атомов, которые управляют когерентным рассеянием, и самокорреляция, которая управляет некогерентным рассеянием10.
Когерентное рассеяние является рассеянием от «среднего» и зависит от относительной фазы рассеянных волн. В малоугловом режиме рассеяния рассеянные нейтронные волны от разных центров рассеяния (разных атомов) конструктивно взаимодействуют (имеют сходные фазы), а коллективное движение атомов наблюдается с сильным усилением интенсивности. Когерентное рассеяние по существу описывает рассеяние одного нейтрона от всех ядер в образце10.
Когда между рассеянными нейтронными волнами из разных центров не возникает конструктивной интерференции, во времени следует один атом, и наблюдается самокорреляция между положением атома в момент времени t = 0 и того же атома в момент времени t. Таким образом, информация об относительных положениях атомов теряется, а фокус делается только на локальных флуктуациях. Рассеяние от локальных флуктуаций управляет некогерентным рассеянием. Некогерентное рассеяние изотропно, способствует фоновому сигналу и ухудшает сигнал-шум10,11.
Объединив все вышеперечисленное, мы выделяем четыре основных процесса рассеяния нейтронов10: (1) упругий когерентный (измеряет корреляции атомных положений), (2) неупругий когерентный (измеряет коллективные движения атомов), (3) упругий некогерентный (способствует фону, уменьшает интенсивность рассеяния на коэффициент Дебая-Уоллера (DWF) и измеряет коэффициент упругой некогерентной структуры (EISF), описывая геометрию диффузионных движений в замкнутой геометрии, и (4) неупругий некогерентный (измеряет динамику одного атома и самокорреляцию).
Динамические процессы, к которым нейтроны могут получить доступ в биологии, варьируются от демпфирования низкочастотных атомных и молекулярных колебаний, взаимодействия молекул растворителей с биоповерхностями и диффузионных процессов в гидратационном слое макромолекул и ограниченной геометрии до прямых поступательных, вращательных и кувыркающихся диффузных движений, белковых доменов и аллостерических движений1 . Широкое разнообразие нейтронных методов и приборов для измерения динамики белка основано на том, как достигается ахроматизация падающего или исходящего пучка нейтронов и как выполняется энергетический анализ рассеянных нейтронов. От трехосевых до спектрометров времени полета, обратного рассеяния и спин-эхо можно исследовать динамические процессы с характерным временем от 1 х 10-14 с до 1 х 10-6 с (фемтосекунды до микросекунд)12.
Национальная лаборатория Оук-Ридж с двумя известными источниками нейтронов, источником нейтронов Spallation – SNS13 и реактором с высоким изотопным потоком – HFIR14, имеет один из лучших наборов спектрометров для исследования динамики в биоматериалах. Некоторые из наиболее красноречивых примеров включают использование спектрометра холодного нейтронного измельчителя (CNCS) в SNS15 для исследования динамического возмущения гидратационной воды вокруг зеленого флуоресцентного белка в растворе16 или субпикосекундных коллективных колебаний нескольких белков17. Повторяющаяся проблема исследований неупругого рассеяния нейтронов заключается в том, что некоторые биологические процессы слишком медленны, чтобы их можно было наблюдать. Без экстремальных установок, которые приводят к огромной потере интенсивности нейтронов, спектрометры времени пролета ограничены разрешением энергии 10 мкЭВ, что соответствует максимальной шкале времени ~ 200 пс10,11. Этого недостаточно для наблюдения крупномасштабных движений в белках. Поэтому часто требуются приборы с более высоким энергетическим разрешением, такие как спектрометры обратного рассеяния. Сочетание методов времени полета и обратного рассеяния оказалось мощным для исследования изменения внутренней динамики цитохрома P450cam (CYP101), фермента, который катализирует гидроксилирование камфоры18.
Микроскопическая диффузия, измеренная спектрометром обратного рассеяния в SNS-BASIS19 , была удивительно хорошо определена и могла быть разделена на диффузионность воды (гидратационная, цитоплазматическая и объемная вода) и диффузионность клеточных компонентов у плоских плоских червей, первого живого животного, изучаемого рассеянием нейтронов20 . Обратное рассеяние является спектроскопическим методом с высоким разрешением, но оно также ограничено несколькими мкэВ = несколькими наносекундами, в то время как медленная динамика в биоматериалах также проявляется как время выживания корреляции между положением атома или ориентацией спина (например, релаксационные процессы, которые регулярно происходят в диапазоне времени от десяти до сотен наносекунд).
Нейтронная спиновая эхо-спектроскопия (NSE) является единственным методом рассеяния нейтронов, достигающим такого высокого разрешения. В отличие от других нейтронных методов, NSE не требует ахроматизации пучка, поскольку использует квантово-механическую фазу нейтронов, которая является их магнитными моментами. Манипулирование магнитными моментами позволяет использовать широкое распределение длин волн пучка нейтронов, при этом методика чувствительна к очень малым изменениям скорости нейтронов порядка 1 х 10-4. NSE был успешно использован для исследования медленной динамики белков в растворе для многих белков. Среди этих многочисленных новаторских исследований мы признаем изучение сегментарной гибкости иммуноглобулина свиней21; связанные доменные движения в Taq полимеразе22; доменные движения в тетрамере дрожжевого спиртдегидрогеназы23; изменение конформации в фосфоглицераткиназе при связывании субстрата3; активация доменных движений и динамическое распространение аллостерических сигналов в белке регуляторного кофактора обмена Na+/H+ 1 (NHERF1) 4,24,25; динамика компактного состояния ртутной ионредуктазы26; и диффузия гемоглобина в эритроцитах27. Два более поздних исследования в области динамики белка выявили гибкость антитела человека Иммуноглобулина G (IgG) в качестве энтропийного источника28 и характеристики вклада растворителя в динамику внутренне неупорядоченного основного белка миелина (MBP)5.
В настоящей статье объясняются основные принципы NSE, множественные подготовительные методы, рекомендуемые для тщательного исследования динамики белка, а также методология и экспериментальный протокол сбора данных NSE на спектрометре NSE в SNS, SNS-NSE. Протокол характеризует два белка: IgG, обычный белок антител человека, и внутренне неупорядоченный белок MBP. Биофизические последствия, исследовательская актуальность примеров и ограничения метода обсуждаются кратко.
NSE спектроскопия, метод измерения медленной динамики
NSE – это поляризованный метод, который использует нейтронное время пролета для измерения обмена энергией (потери поляризации) из-за квазиупругого взаимодействия между нейтронами и атомами в образце. В основе спектроскопии NSE лежат два основных принципа: (1) способность спина нейтрона прецессировать в магнитном поле с частотой, пропорциональной магнитной силе, а именно частоте Лармора29, и (б) спин-эхо или эхо Ханна, представляющее собой манипулирование и перефокусировку поляризационного сигнала при подаче серии радиочастотных импульсов30.
Основы процесса NSE можно резюмировать в нескольких простых шагах 6,11, используя рисунок 1. (1) Пучок нейтронов, создаваемый источником (положение 1), поляризован (положение 2), направляется и транспортируется (положение 3) и поступает на вход в спектрометр NSE, где он поворачивается на 90° первым пи-полуфлаппером (положение 4). (2) Поляризованный пучок (например, магнитные моменты нейтронов) становится перпендикулярным линиям магнитного поля первого магнита (первая зона прецессии, положение 5) и начинает прецессировать. (3) На конце магнита спины нейтронов накапливают определенный угол прецессии, пропорциональный напряженности магнитного поля и времени полета, проведенному внутри (в основном обратно пропорционален скорости нейтрона). Отдельные скорости нейтронов кодируются в пределах угла прецессии в конце первой зоны прецессии. (4) Вблизи положения образца пи-флиппер (положение 6) меняет ориентацию спина на 180°, изменяя знак угла прецессии. (5) Нейтроны взаимодействуют с молекулами образца (позиция 7) и рассеиваются. (6) Рассеянные нейтроны входят и прецессируют во второй зоне прецессии (позиция 8), но становятся обратно ориентированными. (7) Другой пи-полуплащ (положение 9) используется для поворота ориентации спина от перпендикулярного к горизонтальному направлению. Это остановит прецессию, переводя угол прецессии φ в поляризацию, пропорциональную cos(φ). (8) Анализатор (позиция 10) выбирает нейтроны на основе одной ориентации. Если взаимодействие с образцом упругое, скорость нейтрона не изменится. Нейтроны будут проводить одинаковое количество времени, пролетая в первой и второй зонах прецессии, а накопленные углы прецессии полностью восстанавливаются. Полная поляризация восстанавливается на детекторе (позиция 11) как эхо исходной поляризации (т.е. спин-эхо). (9) Однако в NSE рассеяние является квазиупругим, поэтому небольшой обмен энергией между нейтронами и молекулами образца приводит к различным скоростям нейтронов после рассеяния образцом. Из-за различных скоростей нейтроны проведут дополнительное время, пролетая через вторую зону прецессии, и не смогут должным образом восстановить свой угол прецессии. На детекторе извлекается частичная поляризация, а потеря поляризации из-за спиновой релаксации пропорциональна кос-фурье-преобразованию спектральной функции S(Q, ω), промежуточной функции рассеяния F(Q, t). (10) Параметр времени функции F(Q, t) пропорционален напряженности магнитного поля прецессии. Сканирование потери поляризации в зависимости от напряженности магнитного поля дает, следовательно, релаксационную функцию, которая зависит от динамических процессов внутри образца.
Рисунок 1: Фотография спектрометра NSE в SNS (SNS-NSE) и схемы траектории полета нейтронов с наиболее важными функциональными компонентами. Справа налево: 1 = источник нейтронов; 2 = система измельчителей-бендеров-поляризаторов-вторичных затворов; 3 = направляющие для транспортировки луча; 4 = пи/2 флиппера для первого вращения на 90°; 5 = первая зона прецессии; 6 = пи-флиппер для вращения на 180°; 7 = площадь образца и среда отбора проб (здесь показана криопечь); 8 = вторая зона прецессии; 9 = пи/2 флиппера для второго вращения на 90°; 10 = анализатор; 11 = детектор. (Обратите внимание, что части 3, а также 2 и 1 расположены за синей стеной внутри экранирования; измельчители заменены селектором скорости для NSE на основе реактора). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Спектроскопия NSE дает уникальное и подробное представление о динамике белков, которое другие спектроскопические методы не могут дать. Измерения в расширенном масштабе времени обеспечивают наблюдения как за поступательной, так и за ротационной диффузией белков, как представлено здесь…
The authors have nothing to disclose.
В этом исследовании использовались ресурсы в Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biology and Chemistry labs), Офисе научного пользовательского центра Министерства энергетики США, управляемом Национальной лабораторией Оук-Ридж. В этом исследовании также использовались ресурсы реактора MLZ-FRM2 Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) и JCNS1 в Forschungszentrum Jülich GmbH, Германия. Автор благодарит д-ра Ральфа Биля и д-ра Андреаса Штадлера за их помощь в моделировании и их вклад в исследования белков IgG и MBP, д-ра Петра А. Жолнерчука за поддержку сокращения данных NSE, д-ра Чангву До за поддержку измерений SANS и Ронду и д-ра Кевина Вайса за поддержку лаборатории биохимии SNS.
Bovine MBP protein solution | Sigma-Aldrich | M1891 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
D2O – heavy water | Sigma-Aldrich | Product No. 151882 | liquid |
Dionized water | in house | – | for washing / cleanning cells |
DLS instrument | Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich | – | dynamic light scattering instrument |
Elastic scattering standards | SNS-NSE, ORNL | – | Al2O3 and Graphite powders |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 65350-M | 70% ethanol for cleaning cells |
IgG protein solution | Sigma-Aldrich | I4506 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
KWS-2 instrument | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | – | small angle neutron instrument |
Liquinox dish detergent | Alconox | – | Phosphate-free liquid lab glassware cleaner |
Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | Product No.S9390 | disodium phosphate heptahydrate salt |
NaCl | Sigma-Aldrich | Product No.S9888 | sodium chloride salt |
NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | Product No. S9638 | monosodium phosphate monohydrate salt |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Catalog number: ND-2000 | NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer |
Neutron alignment camera | NeutronOptics, Grenoble | NOG210222 | 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor |
Parafilm M – wax parafilm | Bemis | Parafilm M – 5259-04LC PM996 | all-purpose laboratory film in cardboard dispenser |
Phoenix-J-NSE Spectrometer | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | – | neutron spectrometer |
SasView | https://www.sasview.org/ | ||
SAXSpace, Anton Paar instrument | FZ-Jülich | – | small angle x-ray instrument |
Slide-A-Lyzer dialysis membranes | Thermo Scientific | 88400-88405 | Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO |
SNS Remote Analysis Cluster | Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) | https://analysis.sns.gov | |
SNS-NSE spectrometer | ORNL, Oak Ridge, TN, USA | – | neutron spectrometer |
Sterile syringe filters | VWR | N.A. PN:28145-501 | 0.2 µm pore size filters |
Temperature Forcing System (TFS) | SP Scientific | Part Number 100004055 | sample environment equipment |
Urea -d4 | Sigma-Aldrich | Product No. 176087 | deuterated Urea salt |
Viscometer | FZ-Jülich | – | falling ball viscometer |