Untersuchung der Proteindynamik mittels Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von zwei Modellproteinen, die eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielen. Die Technik kombiniert die biophysikalische Charakterisierung auf dem Labortisch mit der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie, um auf die Dynamik auf Zeit- und Längenskalen zuzugreifen, die für Proteininterdomänenbewegungen relevant sind.

Abstract

Die Aktivität und Funktionalität der meisten menschlichen Körperproteine hängt mit Konfigurationsänderungen ganzer Subdomänen innerhalb der Proteinkristallstruktur zusammen. Die Kristallstrukturen bilden die Grundlage für jede Berechnung, die die Struktur oder Dynamik eines Proteins beschreibt, meist mit starken geometrischen Einschränkungen. Diese Einschränkungen aus der Kristallstruktur sind jedoch in der Lösung nicht vorhanden. Die Struktur der Proteine in der Lösung kann sich vom Kristall aufgrund von Umlagerungen von Schleifen oder Subdomänen auf der Pico-Nanosekunden-Zeitskala (d. h. dem internen Proteindynamik-Zeitregime) unterscheiden. Die vorliegende Arbeit beschreibt, wie Zeitlupe auf Zeitskalen von mehreren zehn Nanosekunden mittels Neutronenstreuung erreicht werden kann. Insbesondere die dynamische Charakterisierung von zwei großen menschlichen Proteinen, einem intrinsisch ungeordneten Protein, dem eine klar definierte Sekundärstruktur fehlt, und einem klassischen Antikörperprotein, wird durch Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (NSE) in Kombination mit einer breiten Palette von Laborcharakterisierungsmethoden behandelt. Weitere Einblicke in die Dynamik der Proteindomäne wurden mithilfe mathematischer Modellierung erzielt, um die experimentellen Neutronendaten zu beschreiben und die Überschneidung zwischen kombinierten diffusiven und internen Proteinbewegungen zu bestimmen. Die Extraktion des internen dynamischen Beitrags zur aus NSE erhaltenen Zwischenstreufunktion, einschließlich der Zeitskala der verschiedenen Bewegungen, ermöglicht einen weiteren Einblick in die mechanischen Eigenschaften einzelner Proteine und die Weichheit von Proteinen in ihrer fast natürlichen Umgebung in der überfüllten Proteinlösung.

Introduction

Sondierung der Dynamik weicher Materie mit Neutronen
Die Untersuchung der dynamischen Eigenschaften von Proteinen und Peptiden ist ein wichtiger Teil der biophysikalischen Forschung, und es gibt heute viele gut entwickelte Methoden, um Zugang zu einer Vielzahl von Energielandschaften zu erhalten¹. Die experimentell aufgedeckte Dynamik der Proteine mit ihrer biologischen Funktion in Beziehung zu setzen, ist eine weitaus schwierigere Aufgabe, die komplexe mathematische Modelle und computergestützte Dynamiksimulationen erfordert. Die Bedeutung der Neutronenspektroskopie für die Analyse von Proteinbewegungen wurde in mehreren gut aufgenommenen und weithin anerkannten Studien^{hervorgehoben} 1,2,3,4,5. Bevor die vielfältige Energielandschaft der internen Proteindynamik erforscht wird, ist ein kurzer Überblick über die dynamischen Prozesse in weicher Materie erforderlich und wie Neutronen auf sie zugreifen können.

Die Empfindlichkeit von Neutronen gegenüber der Isotopenkonfiguration und die Art der Wechselwirkungen, die sie mit weicher Materie zeigen, macht die Neutronenstreuung zu einer der vielseitigsten Untersuchungstechniken⁶. Es gibt ein breites Spektrum von Korrelationslängenskalen und Korrelationszeiten, auf die Neutronen zugreifen können, von nuklearen Anregungen und atomaren Schwingungen bis hin zu kollektiven Bewegungen und langsamen Relaxationsprozessen wie isotropen Rotationen und diffusiven Bewegungen. Bei der Untersuchung der gestreuten Neutronen für ihren Energietransfer können drei Hauptwechselwirkungen unterschieden werden: die elastische Streuung, bei der kein Energieaustausch zwischen einfallendem Neutron und Teilchen in der Probe stattfindet; die inelastische Streuung mit einem großen, quantifizierbaren Energieaustausch zwischen Neutron und Teilchen; und der eigentümliche Fall der quasi-elastischen Streuung, der einen sehr kleinen Energietransfer im Vergleich zur einfallenden Neutronenenergie ^1,7 bezeichnet. Diese Wechselwirkungen geben präzise Aufschluss über das untersuchte Material und bilden die theoretische Grundlage verschiedenster Neutronenstreutechniken.

Bei der elastischen Streuung zeichnet der Detektor die Richtungen der Neutronen als Beugungsmuster auf, das die Position der Probenatome relativ zueinander zeigt. Es werden Informationen über die Korrelationen atomarer Positionen gewonnen (d.h. integrierte Intensität S(Q) bezüglich der Impulsübertragung Q, die sich nur auf strukturelle Informationen bezieht). Dieses Prinzip bildet die Grundlage der Neutronenbeugung⁸.

Komplexität entsteht, wenn die Energieübertragung aufgrund von Anregungen und internen Schwankungen im Probenmaterial nicht mehr Null ist. Dies bildet die Grundlage der Neutronenspektroskopie, bei der die gestreuten Neutronen sowohl als Funktion des Energietransfers E als auch des Impulstransfers Q untersucht werden. Es werden dynamische und strukturelle Informationen gewonnen. Die Neutronenspektroskopie misst die gleiche integrierte Intensität S(Q) für den Energietransfer (d.h. Geschwindigkeitsänderung der Neutronen aufgrund der Probenstreuung, S(Q,ω) = S(Q, E), die auch als dynamischer Strukturfaktor bezeichnet wird)⁹.

Zur Berechnung der Streuung aus einem Material ist es sinnvoller, die Paarkorrelationsfunktion ^7,10 zu verwenden. Im Beugungsfall gibt die statische Paarkorrelationsfunktion G(r) die Wahrscheinlichkeit an, den Mittelpunkt eines Teilchens in einem gegebenen Abstand r vom Zentrum eines anderen Teilchens zu finden. Die Spektroskopie verallgemeinert die statische Paarkorrelationsfunktion und bezieht Energie/Frequenz/Zeit in die Streugleichung mit ein. Die Paarkorrelationsfunktion G(r) wird zu einer Funktion der Zeit G(r, t), die in eine ausgeprägte Atompaarkorrelationsfunktion G _D(r, t) und eine Selbstkorrelationsfunktion G_S(r, t) zerlegt werden kann. Diese beschreiben zwei Arten von Korrelationen: paarkorrelierte Bewegungen von Atomen, die die kohärente Streuung steuern, und Selbstkorrelation, die die inkohärente Streuung^{steuert 10}.

Kohärente Streuung ist die Streuung vom “Durchschnitt” und hängt von der relativen Phase der gestreuten Wellen ab. Im Kleinwinkelstreuregime interferieren die gestreuten Neutronenwellen aus verschiedenen Streuzentren (verschiedene Atome) konstruktiv (haben ähnliche Phasen), und die kollektive Bewegung der Atome wird mit starker Intensitätsverstärkung beobachtet. Die kohärente Streuung beschreibt im Wesentlichen die Streuung eines einzelnen Neutrons aus allen Kernen in der Probe¹⁰.

Wenn keine konstruktive Interferenz zwischen den gestreuten Neutronenwellen aus verschiedenen Zentren auftritt, wird ein einzelnes Atom zeitlich verfolgt und die Selbstkorrelation zwischen der Position des Atoms zum Zeitpunkt t = 0 und demselben Atom zum Zeitpunkt t beobachtet. Somit geht die Information über die relativen Positionen von Atomen verloren, und der Fokus liegt nur auf lokalen Fluktuationen. Die Streuung aus lokalen Schwankungen steuert die inkohärente Streuung. Inkohärente Streuung ist isotrop, trägt zum Hintergrundsignal bei und verschlechtert das Signal-Rauschen^10,11.

Wenn wir alle oben genannten Punkte kombinieren, unterscheiden wir vier Hauptneutronenstreuprozesse¹⁰: (1) elastisch kohärent (misst die Korrelationen atomarer Positionen), (2) inelastisch kohärent (misst kollektive Bewegungen von Atomen), (3) elastisch inkohärent (trägt zum Hintergrund bei, reduziert die Streuintensität durch den Debye-Waller-Faktor (DWF) und misst den elastischen inkohärenten Strukturfaktor (EISF), der die Geometrie diffusiver Bewegungen in begrenzter Geometrie beschreibt, und (4) inelastisch inkohärent (misst die Dynamik einzelner Atome und die Selbstkorrelation).

Dynamische Prozesse, auf die Neutronen in der Biologie zugreifen können, reichen von der Dämpfung niederfrequenter atomarer und molekularer Schwingungen, der Wechselwirkung von Lösungsmittelmolekülen mit Biooberflächen und Diffusionsprozessen in der Hydratationsschicht von Makromolekülen und begrenzter Geometrie bis hin zu kurzreichweitigen translationalen, rotationalen und taumelnden diffusiven Bewegungen sowie Proteindomänen und allosterischen Bewegungen¹ . Die große Vielfalt an Neutronenmethoden und -instrumenten zur Messung der Proteindynamik basiert darauf, wie die Achromatisierung des einfallenden oder ausgehenden Neutronenstrahls erreicht wird und wie die Energieanalyse der gestreuten Neutronen durchgeführt wird. Von Dreiachsen- bis hin zu Flugzeit-, Rückstreu- und Spin-Echo-Spektrometern kann man dynamische Prozesse mit charakteristischen Zeiten zwischen 1 x 10-14 s und 1 x ^10-6 s (Femtosekunden bis Mikrosekunden) ^{untersuchen12}.

Das Oak Ridge National Laboratory verfügt mit seinen beiden renommierten Neutronenquellen, der Spallation Neutron Source – SNS¹³ und dem High Isotope Flux Reactor – HFIR¹⁴, über eine der besten Suiten von Spektrometern zur Untersuchung der Dynamik in Biomaterialien. Einige der eloquentesten Beispiele sind die Verwendung des Kaltneutronen-Chopper-Spektrometers (CNCS) bei SNS^15, um die dynamische Störung von Hydratationswasser um grün fluoreszierendes Protein in Lösung¹⁶ oder die kollektiven Schwingungen mehrerer Proteine¹⁷ unter Pikosekunden zu untersuchen. Ein wiederkehrendes Problem der Untersuchungen der inelastischen Neutronenstreuung ist, dass einige biologische Prozesse zu langsam sind, um beobachtet zu werden. Ohne extreme Setups, die zu einem enormen Verlust der Neutronenintensität führen, sind Time-of-Flight-Spektrometer auf eine Energieauflösung von 10 μeV begrenzt, was einer maximalen Zeitskala von ~200 ps^10,11 entspricht. Dies reicht nicht aus, um großräumige Bewegungen in Proteinen zu beobachten. Daher werden häufig Instrumente mit höherer Energieauflösung wie die Rückstreuspektrometer benötigt. Die Kombination der Flugzeit- und Rückstreutechniken hat sich als leistungsfähig erwiesen, um die Veränderung der internen Dynamik von Cytochrom P450cam (CYP101) zu untersuchen, einem Enzym, das den Hydroxylierungskampfer¹⁸ katalysiert.

Die mikroskopische Diffusivität, die mit dem Rückstreuspektrometer an SNS-BASIS¹⁹ gemessen wurde, war überraschend gut definiert und konnte in die Diffusivität von Wasser (Hydratation, zytoplasmatisches und massenartiges Wasser) und die Diffusivität von Zellbestandteilen in planarischen Plattwürmern, dem ersten lebenden Tier, das durch Neutronenstreuung^{untersucht wurde 20}, getrennt werden. . Die Rückstreuung ist eine hochauflösende spektroskopische Technik, die aber auch auf mehrere μeV = mehrere Nanosekunden begrenzt ist, während sich die langsame Dynamik in Biomaterialien auch als Überlebenszeit der Korrelation zwischen atomaren Positionen oder Spinorientierungen manifestiert (z. B. Relaxationsprozesse, die regelmäßig im Zeitbereich von zehn bis Hunderten von Nanosekunden auftreten).

Die Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (NSE) ist die einzige Neutronenstreutechnik, die eine so hohe Auflösung erreicht. Im Gegensatz zu anderen Neutronentechniken erfordert NSE keine Achromatisierung des Strahls, da es die quantenmechanische Phase der Neutronen verwendet, die ihre magnetischen Momente sind. Die Manipulation magnetischer Momente ermöglicht die Verwendung einer breiten Wellenlängenverteilung des Neutronenstrahls, während die Technik empfindlich auf sehr kleine Neutronengeschwindigkeitsänderungen in der Größenordnung von 1 x ^10-4 reagiert. NSE wurde erfolgreich eingesetzt, um die langsame Dynamik von Proteinen in Lösung für viele Proteine zu untersuchen. Unter diesen vielen Pionierstudien erkennen wir die Untersuchung der segmentalen Flexibilität von Schweineimmunglobulin²¹ an; die gekoppelten Domänenbewegungen in Taq-Polymerase²²; die Domänenbewegungen im Tetramer der Hefealkoholdehydrogenase²³; die Änderung der Konformation in der Phosphoglyceratkinase bei Substratbindung³; die Aktivierung von Domänenbewegungen und die dynamische Ausbreitung allosterischer Signale im Na+/H^+-Exchange Regulatory Cofactor 1 (NHERF1)-Protein^4,24,25; die Dynamik eines kompakten Zustands der Quecksilberionenreduktase²⁶; und die Diffusion von Hämoglobin in roten Blutkörperchen²⁷. Zwei neuere Studien zur Proteindynamik haben die Flexibilität des humanen Antikörpers Immunglobulin G (IgG) als entropisches Frühjahr²⁸ und die Eigenschaften des Lösungsmittelbeitrags zur Dynamik des intrinsisch ungeordneten Myelin-Basisproteins (MBP)5 aufgedeckt^.

Der vorliegende Artikel erklärt die Grundprinzipien von NSE, die vielfältigen vorbereitenden Methoden, die für eine gründliche Untersuchung der Proteindynamik empfohlen werden, sowie die Methodik und das experimentelle Protokoll für die NSE-Datenerfassung am NSE-Spektrometer an der SNS, SNS-NSE. Das Protokoll charakterisiert zwei Proteine: IgG, ein normales menschliches Antikörperprotein, und das intrinsisch ungeordnete Protein MBP. Die biophysikalischen Implikationen, die Forschungsrelevanz der Beispiele und die Grenzen der Technik werden kurz diskutiert.

NSE-Spektroskopie, die Methode zur Messung der langsamen Dynamik
NSE ist eine polarisierte Technik, die die Neutronenflugzeit verwendet, um den Energieaustausch (Polarisationsverlust) aufgrund der quasi-elastischen Wechselwirkung zwischen Neutronen und Atomen in einer Probe zu messen. Im Kern der NSE-Spektroskopie liegen zwei Grundprinzipien: (1) die Fähigkeit des Neutronenspins, im Magnetfeld mit einer Frequenz proportional zur magnetischen Stärke zu präzessieren, nämlich der Larmorfrequenz²⁹, und (b) das Spin-Echo oder Hann-Echo, das die Manipulation und Neufokussierung des Polarisationssignals bei Anlegen einer Reihe von Hochfrequenzimpulsen³⁰ darstellt.

Die Grundlagen des NSE-Prozesses können in einigen einfachen Schritten ^6,11 mithilfe von Abbildung 1 zusammengefasst werden. (1) Der von der Quelle erzeugte Neutronenstrahl (Position 1) wird polarisiert (Position 2), geführt und transportiert (Position 3) und erreicht den Eingang des NSE-Spektrometers, wo er vom ersten Pi-Halb-Flipper um 90° gedreht wird (Position 4). (2) Der polarisierte Strahl (z. B. neutronenmagnetische Momente) wird senkrecht zu den Magnetfeldlinien des ersten Magneten (erste Präzessionszone, Position 5) und beginnt zu präzessieren. (3) Am Ende des Magneten akkumulieren Neutronenspins einen bestimmten Präzessionswinkel, der proportional zur magnetischen Feldstärke und der im Inneren verbrachten Flugzeit ist (im Wesentlichen umgekehrt proportional zur Neutronengeschwindigkeit). Die einzelnen Neutronengeschwindigkeiten werden innerhalb ihres Präzessionswinkels am Ende der ersten Präzessionszone kodiert. (4) In der Nähe der Stichprobenposition kehrt der Pi-Flipper (Position 6) die Ausrichtung des Spins um 180° um und ändert das Vorzeichen des Präzessionswinkels. (5) Die Neutronen interagieren mit den Molekülen der Probe (Position 7) und werden gestreut. (6) Die gestreuten Neutronen treten in die zweite Präzessionszone (Position 8) ein und treten in sie vor, werden aber umgekehrt. (7) Ein weiterer Pi-Halb-Flipper (Position 9) wird verwendet, um die Ausrichtung des Spins von senkrecht zur horizontalen Richtung zu drehen. Dadurch wird die Präzession gestoppt, wodurch der Präzessionswinkel φ in eine Polarisation proportional zu cos(φ) übersetzt wird. (8) Der Analysator (Position 10) wählt die Neutronen anhand einer Orientierung aus. Wenn die Wechselwirkung mit der Probe elastisch ist, ändert sich die Geschwindigkeit des Neutrons nicht. Die Neutronen verbringen eine identische Menge an Zeit damit, in der ersten und zweiten Präzessionszone zu fliegen, und die akkumulierten Präzessionswinkel werden vollständig zurückgewonnen. Die volle Polarisation wird auf dem Detektor (Position 11) als Echo der ursprünglichen Polarisation (d.h. Spin-Echo) wiederhergestellt. (9) Bei NSE ist die Streuung jedoch quasi-elastisch, so dass ein kleiner Energieaustausch zwischen Neutronen und Probenmolekülen nach der Streuung durch die Probe zu unterschiedlichen Neutronengeschwindigkeiten führt. Aufgrund der unterschiedlichen Geschwindigkeiten werden die Neutronen eine zusätzliche Zeit damit verbringen, durch die zweite Präzessionszone zu fliegen und ihren Präzessionswinkel nicht richtig wiedererlangt zu haben. Eine partielle Polarisation wird auf dem Detektor abgerufen, und der Verlust der Polarisation aufgrund der Spinrelaxation ist proportional zur cos-Fourier-Transformation der Spektralfunktion S(Q, ω), der Zwischenstreufunktion F(Q, t). (10) Der Zeitparameter der Funktion F(Q, t) ist proportional zur Präzessionsmagnetfeldstärke. Die Abtastung des Polarisationsverlustes in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke ergibt daher eine Relaxationsfunktion, die von den dynamischen Prozessen innerhalb der Probe abhängt.

Abbildung 1: Aufnahme des NSE-Spektrometers am SNS (SNS-NSE) und Neutronenflugbahnschema mit den wichtigsten Funktionskomponenten. Von rechts nach links: 1 = Neutronenquelle; 2 = Chopper-Bender-Polarizer-Sekundärverschlusssystem; 3 = Leitfäden für den Strahltransport; 4 = Pi/2 Flipper für erste 90° Drehung; 5 = erste Präzessionszone; 6 = Pi-Flipper für 180° Drehung; 7 = Probenfläche und Probenumgebung (hier ist der Kryoofen dargestellt); 8 = zweite Präzessionszone; 9 = Pi/2 Flipper für zweite 90° Drehung; 10 = Analysator; 11 = Detektor. (Beachten Sie, dass sich Teile von 3 sowie 2 und 1 hinter der blauen Wand in der Abschirmung befinden; die Chopper werden durch einen Geschwindigkeitswähler für reaktorbasierte NSE ersetzt.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Die vorliegende Arbeit charakterisiert zwei Proteine: ein normales humanes Antikörperprotein IgG und das intrinsisch ungeordnete MBP. Die lyophilisierte Form der Proteine wurde aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). 1. Vorbereitung der Proteinprobe Es wird ein 50 mM Natriumphosphat + 0,1 M NaCl-Puffer hergestellt, indem die jeweiligen festen Reagenzien in schwerem Wasser (D2O) gewogen und gelöst werden (siehe <strong…

Representative Results

IgG-Protein aus humanen Serum- und Rinder-MBP-Proteinen wurde in hohen Konzentrationen (~50 mg/ml) inD2O-Basenpuffernrekonstituiert. Da die Proteine in hohen Konzentrationen gelöst waren, handelte es sich bei den erhaltenen Lösungen um überfüllte Proteinlösungen. Die mit NSE untersuchte Dynamik leidet unter der überfüllten Umgebung, in der sich die Proteine befinden (Strukturfaktorwechselwirkungen und hydrodynamische Effekte)5,28,39<s…

Discussion

Die NSE-Spektroskopie liefert einen einzigartigen und detaillierten Blick auf die Dynamik von Proteinen, den andere spektroskopische Techniken nicht erzeugen können. Messungen über eine erweiterte Zeitskala ermöglichen Beobachtungen sowohl der translationalen als auch der Rotationsdiffusion der Proteine, wie hier dargestellt. Die segmentale Dynamik und andere interne Schwingungen entpuppen sich als starker Zerfall der kohärenten Streufunktion S(Q, t) auf einer kurzen Zeitskala und sind gut von den gesamten d…

Materials

Bovine MBP protein solution	Sigma-Aldrich	M1891	lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O – heavy water	Sigma-Aldrich	Product No. 151882	liquid
Dionized water	in house	–	for washing / cleanning cells
DLS instrument	Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich	–	dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards	SNS-NSE, ORNL	–	Al2O3  and Graphite powders
Ethanol	Sigma-Aldrich	65350-M	70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution	Sigma-Aldrich	I4506	lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	–	small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent	Alconox	–	Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O	Sigma-Aldrich	Product No.S9390	disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl	Sigma-Aldrich	Product No.S9888	sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	Product No. S9638	monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	Catalog number: ND-2000	NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera	NeutronOptics, Grenoble	NOG210222	100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M – wax parafilm	Bemis	Parafilm M – 5259-04LC PM996	all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	–	neutron spectrometer
SasView	https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument	FZ-Jülich	–	small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes	Thermo Scientific	88400-88405	Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster	Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)	https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer	ORNL, Oak Ridge, TN, USA	–	neutron spectrometer
Sterile syringe filters	VWR	N.A. PN:28145-501	0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS)	SP Scientific	Part Number 100004055	sample environment equipment
Urea -d4	Sigma-Aldrich	Product No. 176087	deuterated Urea salt
Viscometer	FZ-Jülich	–	falling ball viscometer