चूहों को Plaisant पशु सुविधा में रखे गए थे, और यह काम इटली के स्वास्थ्य प्राधिकरण संख्या 1065/2015-पीआर मंत्रालय के तहत किया गया था । प्रोटोकॉल राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय कानूनों और नीतियों (UE निर्देश 2010/63/UE) के अनुसार पशु देखभाल दिशा निर्देशों का पालन किया; इतालवी विधायी डिक्री 26/2014) । 1. मध्यम और धुंधला समाधान की तैयारी तैयार करें पूरा माध्यम: रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) माध्यम 2 एमएमएम ग्लूटामाइन के साथ, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 माइक्रोन बीटा-मर्केप्टोथेनॉल, और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) की 10% मात्रा/मात्रा (v/v) दाग बफर तैयार करें: 1% वजन/मात्रा (w/v) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 2 एमएम एथिलीनडाइमाएंट्रेएक्टिक एसिड डिसोडियम नमक (EDTA) के साथ Ca2 +/mg2 + (PBS) के बिना फॉस्फेट-बफर खारा 2. माउस उपचार प्राइम 7-8-वीक, मादा बाल्ब/सी चूहों द्वारा इंट्रामस्क्युलर (i.m)) मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) के क्वाड्रिसेप्स में इंजेक्शन-1-गैग-एक्सप्रेसिंग-चिंपांजी एडेनोविरल वेक्टर (ChAd3-gag) १०७ वायरल कणों की खुराक के साथ । भड़काना के बाद 1-4 महीने में, एक बार एचआईवी के .m इंजेक्शन द्वारा चूहों को बढ़ावा-1-चुप-संशोधित vaccinia अंकारा वायरस (MVA-चुप) १०६ पट्टिका बनाने इकाइयों की एक खुराक के साथ व्यक्त । बढ़ावा देने के बाद 3 दिन में, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बढ़ाया चूहों का बलिदान, और अनुपचारित चूहों के साथ समानांतर में उनका विश्लेषण। क्वाड्रिसेप्स (इलियाक, पॉपलाइटल, और इंगिनल) और बूस्ट और अनुपचारित चूहों से प्लीहा को निकालने वाले एलएनएस को फसल करें। इसके अलावा, अनुपचारित चूहों से दो पिछले पैरों से बीएम इकट्ठा करें, और प्रवाह साइटोमीटर सेटिंग्स के लिए और सेल चक्र विश्लेषण(चित्रा 2)के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस बीएम का उपयोग करें।नोट:पहले12, 15, 16, 17वर्णित ChAd3-gag और एमवीए-गैग वैक्टर उत्पन्न करें । 3. एलएन, तिल्ली और बीएम कोशिकाओं को निकालने का अलगाव तिल्ली और एलएन कोशिकाओं का अलगाव दो 15 एमएल ट्यूबों में से प्रत्येक में पूर्ण माध्यम के 5 एमएल रखें, और अंगों को एकत्र करने के लिए तैयार, उन्हें बर्फ पर रखें। सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा एक वयस्क माउस का बलिदान करें। माउस को अपनी पीठ पर रखें, और 70% v/v इथेनॉल के साथ त्वचा की सतह को निष्फल करें। इंजिनियल एलएन इकट्ठा करने के लिए, कैंची के साथ पेट पर ~ 1 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा बनाएं, और संदंश के साथ चीरा फैलाएं। त्वचा की आंतरिक सतह पर इंगिनल एलएन की कल्पना करें, और उन्हें संदंश के साथ फसल करें। स्टेप 3.1.1 में तैयार दो 15 एमएल ट्यूब में से एक में इंजिनियल एलएन रखें। तिल्ली इकट्ठा करने के लिए कैंची से पेरिटोनियल चीरा लगाकर तिल्ली निकाल लें। आसपास के कनेक्टिव टिश्यू को काटने के बाद, प्लीहा को दूसरे 15 एमएल ट्यूब में रखें जो चरण 3.1.1 में तैयार किया गया है। इलियाक एलएन इकट्ठा करने के लिए, आंतों को एक तरफ ले जाएं और अवर वेना कावा के करीब इलियाक एलएन की कल्पना करें, और फिर उन्हें संदंश का उपयोग करके इकट्ठा करें। इलियाक एलएन को एक ही ट्यूब में रखें जिसमें इंजिनियल एलएन हो।नोट: धुंधला (धारा 4 देखें) के लिए पर्याप्त एलएन कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, अक्सर एक माउस से पॉपलाइटल, इंगिनल और इलियाक एलएन पूल करना आवश्यक होता है। ये सभी एलएन क्वाड्रिसेप्स (आई.m टीकाकरण की साइट) को सूखा रहे हैं। यह प्रोटोकॉल पूल किए गए एलएन की केवल एक 15 एमएल ट्यूब का उपयोग करता है। पॉपलाइटल एलएन इकट्ठा करने के लिए, पिछले पैरों की त्वचा को समझें और मांसपेशियों को उजागर करने के लिए धीरे-धीरे इसे नीचे की ओर खींचें। फिर, घुटने के जोड़ के नीचे मांसपेशियों के बीच संदंश डालें, और पॉपलाइटल एलएन एकत्र करें। पॉपलाइटल एलएन को एक ही ट्यूब में रखें जिसमें इंजिनियल और इलियाक एलएन होते हैं।नोट: 3.1.7 के बाद नोट देखें। तिल्ली को 5 मिमी संस्कृति के 5 एमएल से भरे 60 मिमी संस्कृति पकवान के भीतर 70 माइक्रोन सेल छलनी में रखें। 5 एमएल सिरिंज प्लंजर का उपयोग करके, धीरे-धीरे अंग को तब तक मैश करें जब तक कि इसकी पूरी डिसैगरेशन न हो जाए। छलनी निकालें, और सेल निलंबन को एक साफ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। संस्कृति पकवान के लिए पूरा माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, और ध्यान से पकवान और छन्नी धोने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को बरामद किया गया है । 15 एमएल ट्यूब में तिल्ली सेल निलंबन के बाकी के साथ पूल। पूल्ड इंगिनल, इलियाक और पॉपलाइटल एलएन के लिए, तिल्ली के लिए चरण 3.1.9 से 3.1.11 में उपयोग की जाने वाली इसी प्रक्रिया के बाद एक एकल सेल निलंबन तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। सुपरनैंट को त्यागें, और पीबीएस में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें। लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर और पीबीएस में 0.04% v/v ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके न्यूबॉर चैंबर के साथ कोशिकाओं की गणना करें। बीएम कोशिकाओं का अलगाव 15 एमएल ट्यूब में 5 एमएल कंप्लीट मीडियम रखें, और इसे बर्फ पर रखें, जो पिछले पैरों के कलेक्शन के लिए तैयार है । सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा एक वयस्क माउस का बलिदान करें। 70% v/v इथेनॉल के साथ त्वचा की सतह को स्टरलाइज करें। कैंची के साथ वेंट्रल त्वचा पर ~ 1 सेमी ट्रांसवर्स चीरा बनाएं, कट के दोनों किनारों पर त्वचा को दृढ़ता से समझें, और पिछले पैरों की मांसपेशियों को उजागर करने के लिए धीरे-धीरे नीचे की ओर खींचें। पिछले पैरों के पीछे से त्वचा को खत्म करने के लिए, माउस को एक रीढ़ की स्थिति में रखते हुए, क्लैंप को घुटने के नीचे रखें, और मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए ऊपर की ओर खींचें। एक हिंद पैर के दो छोर पर हड्डियों को काटें: श्रोणि/कूल्हे के जोड़ और टखने । दोनों पिछले पैरों को चरण 3.2.1 में तैयार 15 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें। 15 एमएल ट्यूब से पिछले पैरों को लें और उन्हें टिश्यू पेपर में स्थानांतरित करें। टिबिया को दूर करने के लिए घुटने के जोड़ के ठीक नीचे पिछले पैरों को काट लें। आसपास की मांसपेशियों से फीमर और टिबिया को विच्छेदन करें, कैंची का उपयोग करके अतिरिक्त ऊतक निकालें, और ऊतक पेपर को गीला करें। आंतरिक मज्जा शाफ्ट का पर्दाफाश करने के लिए कैंची के साथ हड्डी समाप्त होता है काटें। बीएम निष्कर्षण ट्यूब में टिबिया और फीमर डालें (नीचे सबसे व्यापक अंत के साथ 3.2.9.1-3.2.2.18 में तैयारी देखें। टिप के अंत के ठीक ऊपर और 100 माइक्रोल लाइन पर लाइन पर 200 माइक्रोन पिपेट टिप काटें। मध्य भाग को टिप के ऊपरी, बड़े हिस्से में रखें, और इसे 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में रखें। 1 मिनट के लिए 800 × जी पर बीएम निष्कर्षण ट्यूब स्पिन। हड्डी को त्यागें, और किसी भी समूह को हटाने के लिए पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में गोली को सख्ती से फिर से खर्च करें। 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर रखे गए 70 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। बीएम निष्कर्षण ट्यूब को हर बार 1 एमएल पूर्ण माध्यम से धोएं। एक 70 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, और चरण 3.2.11 में प्राप्त शेष सेल निलंबन के साथ वॉल्यूम पूल करें।नोट: एक एकल 15 एमएल ट्यूब में माउस के दोनों पिछले पैरों से कोशिकाएं होंगी। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। सुपरनेट को त्यागें, और पीबीएस में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर और पीबीएस में 0.04% v/v ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके न्यूबॉर चैंबर के साथ कोशिकाओं की गणना करें। 4. तिल्ली, एलएन, और बीएम कोशिकाओं का धुंधला सेल नमूनों को 3 उपसमूहों में दाग दिया जाएगा: मुआवजे के लिए सेल नमूने,अनुपचारित चूहों से बीएम कोशिकाओं सहित केवल Hoechst ३३३४२ के साथ दाग हो (अब से Hoechst के रूप में संदर्भित) और अनुपचारित चूहों से तिल्ली कोशिकाओं को मृत सेल डाई मुआवजे के लिए एक मृत/लाइव सेल मिश्रण तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा; कोशिका चक्र विश्लेषण के लिए सकारात्मक नियंत्रण,अनुपचारित चूहों से बीएम नमूना शामिल है; और अनुपचारित और टीका लगाया चूहों से तिल्ली और एलएन नमूनों युक्त प्रयोगात्मक नमूने ।नोट: सुनिश्चित करें कि गैग-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या के विश्लेषण के लिए पर्याप्त तिल्ली और एलएन कोशिकाएं हैं। यह अक्सर पूल तिल्ली कोशिकाओं का उपयोग करें और 3 टीका लगाया चूहों से पूल एलएन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए आवश्यक है और पूल्ड कोशिकाओं के दो या अधिक समान नमूनों दाग, प्रत्येक 3 × १०६ कोशिकाओं युक्त । Hoechst धुंधला के कदम पर समान नमूनों को मर्ज करें। इसी तरह, दाग 3 अनुपचारित चूहों से तिल्ली कोशिकाओं और एलएन कोशिकाओं पूल, और अंत में समान नमूनों विलय । उपकरण और क्षतिपूर्ति सेटअप के लिए उपयोग किए जाने वाले अनुपचारित माउस से तिल्ली कोशिकाओं का एक अन दाग नमूना अलग सेट करें। मृत सेल डाई क्षतिपूर्ति के लिए मृत/लाइव सेल मिश्रण तैयार करें (कोशिकाओं का यह मिश्रण केवल मृत सेल डाई के साथ दाग दिया जाएगा)। 65 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान गर्म करें। तिल्ली कोशिकाओं का एक aliquot ले लो (~ 3 × 106)। सेल सस्पेंशन को माइक्रोफ्यूज ट्यूब में ट्रांसफर करें, इसे 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें, और फिर तुरंत इसे 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। 1:1 के अनुपात में जीवित तिल्ली कोशिकाओं (~ 3 ×10 6)के साथ गर्मी से मारे गए कोशिकाओं को मिलाएं, और मिश्रण के आधे हिस्से को 96 अच्छी तरह से गोल नीचे की प्लेट में स्थानांतरित करें (~ 3 × 106 कोशिकाएं/ प्रायोगिक नमूनों की मृत कोशिका धुंधला, सेल चक्र विश्लेषण के लिए सकारात्मक नियंत्रण और मृत/ तिल्ली, एलएन, बीएम कोशिकाओं (3 × १० ६ कोशिकाओं/अच्छीतरह से) हस्तांतरण, और मृत/लाइव सेल मिश्रण (धारा ४.२) ९६ में अच्छी तरह से गोल नीचे थाली, धुंधला योजना (कदम ४.१) के अनुसार, और ४०० × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र । पीबीएस में पतला मृत सेल डाई के 50 माइक्रोन में प्रत्येक सेल गोली को फिर से रीसुस्ट करें, और तुरंत 3 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके पुनर्व्यवित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित। धुंधला बफर के साथ 2 बार कोशिकाओं को धोएं; 200 माइक्रोन के साथ पहली बार और दूसरी बार 250 माइक्रोन के साथ। प्रत्येक धोने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 × जी पर प्लेट अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्यागें, और पीबीएस के 20 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। प्रमुख हिस्टोकंप्यूटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी)-पेप्टाइड मल्टीमर्स और एमएबी के साथ झिल्ली सेल धुंधला । स्टेनिंग स्कीम (फ्लो साइटोमीटर सेटिंग्स, टेबल 1)के अनुसार आवश्यक मात्रा को ध्यान में रखते हुए, निम्नलिखित रिएजेंट तैयार करें: उचित कमजोर पड़ने के अनुसार धुंधला बफर में तनु mAb 2.4G2 (सामग्री की तालिकादेखें); प्रत्येक नमूने को दाग लगाने के लिए, इस कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन का उपयोग करें।नोट: 2.4G2 mAb ब्लॉक गैर-एंटीजन-विशिष्ट FcγIII और FcγII रिसेप्टर्स के लिए इम्यूनोग्लोबुलिन के बाध्यकारी । उचित कमजोर पड़ने (सामग्रीकी तालिका देखें) प्राप्त करने के लिए धुंधला बफर में एच-2k (d) AMQMLKETI allophycocyanin (एपीसी) लेबल टेट्रामर (Tetr-gag) पतला; प्रत्येक नमूने को दागदार करने के लिए, इस कमजोर पड़ने के 20 माइक्रोन का उपयोग करें। उपयुक्त कमजोर पड़ने के अनुसार धुंधला बफर में एमएबी को पतला करके एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें) जो पहले टिटरेशन प्रयोगों में निर्धारित किया गया है; प्रत्येक नमूने को दाग लगाने के लिए, इस एंटीबॉडी मिश्रण के 20 माइक्रोन का उपयोग करें।नोट: यहां, एंटी-सीडी3ई पेरिडिन क्लोरोफिल प्रोटीन (PerCP-Cy5.5) (क्लोन 145-2C11), एंटी-सीडी 8ए शानदार पराबैंगनी (BUV805) (क्लोन 53-6.7), और एंटी-सीडी62एल फाइकोरीथ्रिन सायनिन7 (PECy7) (क्लोन मेल-14) का उपयोग किया गया । पहले पतला 2.4 G2 mAb (चरण 4.4.1.1) के 10 माइक्रोन जोड़ें, और प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पहले पतला Tetr-gag एपीसी (कदम 4.4.1.2) और एच-2k (d) AMQMLKETI phycoerythrin (पीई) पेंटामर (दबी हुई झूठ) के 10μL जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित। पहले से तैयार एंटीबॉडी मिश्रण (चरण 4.4.1.3) के 20 माइक्रोन जोड़ें, और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट इनक्यूबेट करें।नोट: इसलिए, अंतिम मात्रा प्रति अच्छी तरह से 80 माइक्रोन है (चरण 4.3.5, चरण 4.4.2 से 4.4.4)। धुंधला बफर के 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × जी पर सेंट्रलाइज। 250 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें, और सेल सस्पेंशन को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में 1 एमएल धुंधला बफर जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × जी पर अपकेंद्रित्र करें। बीएम कोशिकाओं के aliquot ले लो (3 × १०६ कोशिकाओं) (सेल नमूनों की सूची देखें, धारा ४.१) Hoechst चैनल क्षतिपूर्ति करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए (Hoechst ३३३४२ एक पराबैंगनी लेजर (प्रवाह साइटोमीटर सेटिंग्स(तालिका 2))से उत्साहित है, और सेल निलंबन एक 5 mL ट्यूब में स्थानांतरित । ट्यूब में 1 एमएल धुंधला बफर जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × जी अपकेंद्रित्र करें। 5. फिक्सेशन/पारमेबिलाइजेशन निर्माता के निर्देशों के अनुसार निर्धारण/पारमेबिलाइजेशन मंद के 3 भागों के साथ निर्धारण/पारमेबिलाइजेशन ध्यान के 1 भाग को कमजोर करके नए सिरे से निर्धारण/पारमेबिलाइजेशन बफर तैयार करें । पैलेट और नाड़ी भंवर को पैलेट को पूरी तरह से अलग करने के लिए नमूनों को त्यागें। प्रत्येक ट्यूब में ताजा तैयार निर्धारण/पारमेबिलाइजेशन बफर के 1 एमएल जोड़ें, जिसमें अन दाग तिल्ली कोशिकाओं के साथ एक ट्यूब (3 x 106,सेल नमूनों की सूची देखें, धारा 4.1), और भंवर। 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट।नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । 6. इंट्रासेलुलर धुंधला Ki67 धुंधला निर्माता के निर्देशों के अनुसार, आसुत पानी के साथ पारशीलीकरण बफर 10x को पतला करके ताजा पारमेबिलाइजेशन बफर 1x तैयार करें। उपयोग से पहले, पारमेबिलाइजेशन बफर 1x को समुच्चय को खत्म करने के लिए 0.45 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए। पतला mAb Ki67 फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट (फिटसी) (क्लोन सोला15) में परमेबिलाइजेशन बफर 1x (सामग्री की तालिकादेखें), जैसा कि पहले टिटरेशन प्रयोगों (प्रति नमूना 100 माइक्रोल की अंतिम मात्रा) में निर्धारित किया गया था। प्रत्येक ट्यूब में परमीबिलाइजेशन बफर 1x का 3 एमएल जोड़ें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्यागें और चरण 6.1.3 दोहराएं। सुपरनैंट को त्यागें, और पहले पतला mAb Ki67 FITC (चरण 6.1.2) के 100 माइक्रोल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित। परिधि बफर 1x के 4 एमएल के साथ 2 बार कोशिकाओं को धोएं। आरटी में 5 मिनट के लिए 400 × जी पर प्रत्येक धोने अपकेंद्रित्र के लिए। निम्नलिखित खंडों पर विचार करते हुए पीबीएस में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें: नमूनों के लिए पीबीएस के 350 माइक्रोन प्रवाह साइटोमीटर पर सीधे प्राप्त किए जाएंगे; नमूनों के लिए पीबीएस के 250 μL प्रवाह साइटोमेट्री (धारा 6.2) से पहले शीघ्र ही Hoechst के साथ इनक्यूबेटेड किया जाएगा। डीएनए धुंधला प्रत्येक नमूने में पीबीएस में 4 μg/mL Hoechst के २५० μL जोड़ें (Hoechst की अंतिम एकाग्रता 2 μg/mL है) ।नोट: यदि पीबीएस में 250 माइक्रोन के दो या अधिक समान नमूने तैयार किए गए थे, तो उन्हें इस चरण में मर्ज करें, और पीबीएस में 4 माइक्रोन/एमएल होचस्ट समाधान की समान मात्रा जोड़ें (Hoechst की अंतिम एकाग्रता 2 μg/l है)। कोशिकाओं की संख्या डीएनए धुंधला कदम को बहुत प्रभावित करती है। प्रत्येक नमूने में एक ही सेल नंबर का उपयोग करें। ध्यान रखें कि यहां तक कि थोड़ा कम सेल संख्या (उदाहरण के लिए, पिछले धोने के चरणों में सेल हानि के कारण) डीएनए और उच्च Hoechst तीव्रता के लिए बाध्यकारी उच्च Hoechst में परिणाम है । आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित। 400 × जी पर नमूनों को आरटी में 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें। पीबीएस के 350 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रीस्ब करें। 7. मुआवजा मनका नमूनों की तैयारी धुंधला बफर में उचित रूप से एमएबी को पतला करके एंटीबॉडी के 5 माइक्रोन तैयार करें।नोट: प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एमएबी के लिए, इसकी इसी क्षतिपूर्ति मनका नमूना तैयार करें। भंवर नकारात्मक नियंत्रण और विरोधी चूहा/हम्सटर आईजी, उपयोग से पहले Comp मोती । प्रत्येक नमूने के लिए, नकारात्मक नियंत्रण CompBeads की एक बूंद (~ 20 μL) और विरोधी चूहा की एक बूंद/ ट्यूब में पूर्वारक्षित एंटीबॉडी (चरण 7.1) के 5 माइक्रोन जोड़ें, और ऊपर और नीचे पिपेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित। धुंधला बफर के 2 एमएल के साथ नमूने धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × जी पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें, और प्रत्येक ट्यूब और भंवर में पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़कर गोली को फिर से खर्च करें। 8. उपकरण और मुआवजा सेटअप और प्रवाह साइटोमीटर पर प्रयोगात्मक नमूना अधिग्रहण नोट: साइटोमीटर कॉन्फ़िगरेशन के लिए फ्लो साइटोमीटर सेटिंग्स(टेबल 2)को देखें। सामान्य साधन और मुआवजा सेटअप नमूना अधिग्रहण (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए सॉफ्टवेयर खोलें, और कार्यक्षेत्र रिबन अनुभाग में नए प्रयोग पर क्लिक करके और नए खाली प्रयोगका चयन करके एक नया प्रयोग बनाएं। इसे खोलने के लिए बनाए गए प्रयोग पर डबल क्लिक करें। साइटोमीटर सेटिंग्स विंडो में, मापदंडों पर क्लिक करें और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) पैरामीटर सहित स्टेनिंग पैनल में उपयोग किए जाने वाले सभी चैनलों (जैसे, पीई, एपीसी, आदि) का चयन करें। लॉग स्केल को अनचेक करके एक होचस्ट पैरामीटर के रूप में रैखिक पैमाने का चयन करें, और एफसीएस, एसएससी और होचस्ट के लिए वोल्टेज पल्स की चौड़ाई (डब्ल्यू) की जांच करें।नोट: सभी पैरामीटर लॉगरिथमिक (लॉग) स्केल में डिफ़ॉल्ट रूप से दिखाए जाते हैं, सिवाय एफएससी और एसएससी जो रैखिक पैमाने पर हैं। सभी मापदंडों का विश्लेषण वोल्टेज पल्स के क्षेत्र (ए) और ऊंचाई (एच) द्वारा किया जाता है। ग्लोबल वर्कशीटपर वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और एसएससी-ए पर एफएससी-ए के साथ डॉट प्लॉट बनाएं । अधिग्रहण डैशबोर्ड पर अधिग्रहण डेटा पर क्लिक करके अन दाग तिल्ली नमूना चलाएं। पैरामीटर अनुभाग में वोल्टेज मूल्यों को संशोधित करके कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए उपयुक्त एफएससी और एसएससी सेटिंग्स सेट करें, और ग्लोबल वर्कशीटके कार्यक्षेत्र टूलबार पर बहुभुज गेट पर क्लिक करके एफएससी-ए/एसएससी-ए डॉट प्लॉट में प्रदर्शित सभी कोशिकाओं का चयन करने के लिए एक गेट बनाएं। एक्स-एक्सिस पर प्रत्येक फ्लोरेसेंस पैरामीटर के साथ हिस्टोग्राम में गेटेड कोशिकाओं को प्रदर्शित करें। प्रत्येक फ्लोरेसेंस पैरामीटर के लिए दाग कोशिकाओं के नकारात्मक और सकारात्मक संकेतों के बीच एक स्पष्ट जुदाई है फ्लोरेसेंस डिटेक्टर (पीएमटी) को समायोजित करने के लिए दागदार और पूरी तरह से दाग तिल्ली नमूनों को चलाएं। क्षतिपूर्ति सेटअप करने के लिए, कार्यक्षेत्र रिबन में प्रयोग पर क्लिक करें और क्षतिपूर्ति सेटअप अनुभाग के तहत, क्षतिपूर्ति नियंत्रण बनाएंका चयन करें। अनियंत्रित अनग्रेस्ड कंट्रोल ट्यूब/वेल और क्लिक करें ठीक हैशामिल हैं ।नोट: इस ऑपरेशन के परिणामस्वरूप मुआवजा नियंत्रण नाम के एक नमूने और प्रत्येक चयनित पैरामीटर के अनुरूप कई शीट युक्त एक सामान्य वर्कशीट का निर्माण होगा। मुआवजे के मोतियों का एक नमूना चलाएं (धारा 7 देखें); साइटोमीटर विंडो में एफएससी मापदंडों पर वोल्टेज मूल्यों और 5,000 की अधिग्रहण सीमा को संशोधित करके मोतियों की कल्पना करने के लिए उपयुक्त एफएससी और एसएससी सेटिंग्स सेट करें। मनका आबादी पर P1 गेट समायोजित करें, और जांच करें कि सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों दोनों एक्स-अक्ष पर दिखाई दे रहे हैं। प्रत्येक मुआवजा मनका नमूने के लिए इस ऑपरेशन को दोहराएं, और अंत में अधिग्रहण डैशबोर्ड पर रिकॉर्ड डेटा पर क्लिक करके प्रत्येक नमूना फ़ाइल रिकॉर्ड करें (प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम 5,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें)। प्रत्येक दर्ज मनका नमूना के लिए, क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों पर P2 और P3 फाटकों सेट । मुआवजे के लिए सेल नमूने चलाएं (चरण 4.2 और 4.4.7 देखें, और धारा 5 और 6)। एफएससी और एसएससी वोल्टेज को संशोधित करें और कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए दहलीज मूल्य, P1 गेट को समायोजित करें, और अंत में प्रत्येक नमूना फ़ाइल को रिकॉर्ड करें (कम से कम 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें)। क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों पर P2 और P3 गेट्स सेट करें ।नोट: Hoechst चैनल के मुआवजे के लिए, नकारात्मक चोटी (P3) और जी 2 /M के रूप में सकारात्मक एक(P2)के रूप में जी0/जी1 का उपयोग करें । कार्यक्षेत्र रिबन अनुभाग में प्रयोग पर क्लिक करें और मुआवजा सेटअप अनुभाग में, मुआवजे की गणना काचयन करें । निर्मित क्षतिपूर्ति सेटिंग, लिंक का नाम दें, और इसे वर्तमान प्रयोग में सहेजें। प्रायोगिक नमूना अधिग्रहण ब्राउज़र टूलबार पर नए नमूने पर क्लिक करके एक नमूना खोलें, और ग्लोबल वर्कशीटमें गेटिंग रणनीति बनाएं।नोट: नमूना अधिग्रहण की गेटिंग रणनीति नमूना विश्लेषण के समान है, जिसे चित्र 3 और धारा 9 में वर्णित किया गया है। एक्स-एक्सिस पर सीडी 3-ए के साथ एक हिस्टोग्राम में सभी इवेंट पॉपुलेशन प्रदर्शित करें। केवल सीडी 3+ कोशिकाओं का चयन करने के लिए एक अंतराल गेट बनाएं। अधिग्रहण डैशबोर्डपर, एलएन नमूनों के लिए सभी घटनाओं के रूप में भंडारण गेट का चयन करें, और या तो सभी घटनाओं या सीडी 3+ कोशिकाओं तिल्ली नमूनों के लिए । कम गति से प्रयोगात्मक नमूनों को चलाने के लिए, और अंत में टीका लगाया चूहों से प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम 100-200 एंटीजन विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सभी फ़ाइलों को रिकॉर्ड।नोट: प्रयोगात्मक नमूनों की फाइल आकार आमतौर पर बड़ा (30-120 एमबी) होता है, खासकर जब एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं की आवृत्ति कम होती है। इसलिए, घटनाओं की उच्च संख्या (> 1 × 106)को कम से कम 100-200 एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं को रिकॉर्ड करने के लिए एकत्र किया जाना चाहिए। बड़ी फाइलें बाद की डेटा विश्लेषण प्रक्रिया को धीमा कर सकती हैं। तिल्ली के नमूनों में केवल CD3+ कोशिकाओं का अधिग्रहण (ऊपर चरण 8.2.2 देखें) फ़ाइल आकार को छोटा रखने के लिए उपयोगी है। चलाएं और कक्ष चक्र विश्लेषण के लिए सकारात्मक नियंत्रण रिकॉर्ड करें, यानी अनुपचारित चूहों से बीएम नमूना। 9. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्रियों की तालिकादेखें), और कार्यक्षेत्र रिबन अनुभाग में क्रिएट ग्रुप पर क्लिक करके विश्लेषण किए जाने वाले विभिन्न अंगों के अनुरूप विभिन्न समूह बनाएं (यानी, समूह “ए-एलएन” बनाएं; “बी-तिल्ली”; “सी-बीएम”) ।नोट: नव निर्मित समूह समूह सूची में दिखाई देंगे, जबकि “मुआवजा” समूह स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न होता है। समूह के नाम पर डबल क्लिक करके संशोधित समूह विंडो खोलें, और जांच करें कि नवनिर्मित समूह सिंक्रोनाइज्ड हैं। यदि नहीं, तो फ़ंक्शन सिंक्रोनाइज्डपर एक चेकमार्क डालें। अपने संबंधित समूह में प्रत्येक .fcs फ़ाइल खींचें। “ए-एलएनएस” समूह से शुरू होने वाली गेटिंग रणनीति बनाएं। ग्राफ विंडो खोलने के लिए समूह में पूरी तरह से दाग वाले नमूने पर डबल क्लिक करें; एक्स-एंड वाई-एक्सिस को एफसीएस फाइल्स (फ्लो साइटोमीटर सेटिंग्स, टेबल 2देखें) के रूप में लेबल किया गया है। इस नमूने के लिए प्राप्त कुल घटनाओं को एक्स-एक्सिस पर डीएनए-ए और वाई-एक्सिस पर डीएनए-डब्ल्यू के साथ एक डॉट प्लॉट में प्रदर्शित करें। ग्राफ विंडो के गेटिंग टूल सेक्शन में आयत पर क्लिक करके केवल एकल सेल आबादी का चयन करें।नोट: एकल कोशिकाओं में डीएनए-ए मान इस प्रकार होता है: 2N (कम): 2N और 4N (मध्यवर्ती) के बीच, या 4N (उच्च) के बराबर है, जबकि डीएनए-डब्ल्यू मूल्य उन सभी के लिए समान हैं (चित्र 3के चरण 1)। आयताकार गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और डेड सेल डाई पर एफएससी-ए पैरामीटर के साथ डॉट प्लॉट में सिंगल सेल प्रदर्शित करें । ग्राफ विंडो के गेटिंग टूल सेक्शन में पॉलीगॉन पर क्लिक करके केवल लाइव सेल पॉपुलेशन चुनें। मृत कोशिका डाई (चित्र 3के चरण 2) के लिए लाइव कोशिकाएं नकारात्मक हैं। पॉलीगोनल गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और एसएससी-ए पैरामीटर पर एफएससी-ए पैरामीटर के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए। आयतपर क्लिक करें, और उस ग्राफ12 (चित्र 3के चरण 3) में सभी एकल जीवित कोशिकाओं को शामिल करने के लिए एक “आराम” गेट बनाएं। वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और सीडी 8 पर सीडी 3 के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए “आराम” गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें। पॉलीगॉन (चित्रा 3के चरण 4) पर क्लिक करके CD3+CD8+ कोशिकाओं का चयन करें । सीडी 3+सीडी8+ गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें एक्स-एक्सिस पर टेटर-गैग और वाई-एक्सिस पर पेंट-गैग के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए। पॉलीगॉन (चित्र 3के चरण 5) पर क्लिक करके एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं (टेटर-गैग और पेंट-गैग दोनों के लिए सकारात्मक) का चयन करें। वाई-एक्सिस(चित्रा 4)पर एक्स-एक्सिस और Ki67 पर डीएनए-ए के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए गैग-स्पेसिफिक गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें। ग्राफ विंडो के गेटिंग टूल सेक्शन में क्वाड पर क्लिक करके विभिन्न सेल चक्र चरणों में कोशिकाओं का चयन करें।नोट: जी0 चरण में सेल Ki67neg-डीएनए कम कोशिकाओं (नीचे छोड़ दिया चतुर्भुज) हैं; जी1 में कोशिकाएं Ki67pos-डीएनए कम (ऊपरी बाएं चतुर्भुज) हैं; एस-जी2/एममें कोशिकाएं Ki67pos-DNA मध्यवर्ती/उच्च (शीर्ष सही चतुर्भुज)(चित्रा 4)हैं । समूह के सभी नमूनों के लिए फाटक लागू करने के लिए इसी समूह के लिए एक नमूने में बनाई गई गेटिंग रणनीति की प्रतिलिपि। “ए-एलएन समूह” के लिए चरण 9.5 से 9.18 तक दोहराएं। जांच करें कि सभी द्वार “बी-तिल्ली” समूह के प्रत्येक नमूने के लिए उपयुक्त हैं। बीएम कोशिकाओं (सकारात्मक नियंत्रण) के बीच सेल चक्र का विश्लेषण करने के लिए, वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और Ki67 पर डीएनए-ए के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए “आराम” गेट के केंद्र में क्लिक करें। जांच करें कि सभी गेट 3 समूहों के प्रत्येक नमूने के लिए उपयुक्त हैं (यानी, तिल्ली, एलएन और बीएम से कोशिकाओं के लिए)।नोट: एकल सेल जनसंख्या गेट (चरण 9.7) और सेल चक्र के लिए क्वाड गेट (चरण 9.17) में विभिन्न नमूनों में अलग-अलग गेट निर्देशांक हो सकते हैं, मुख्य रूप से नमूनों (धारा 6.2) के बीच होचस्ट डाई तीव्रता के संभावित मामूली अंतर के कारण। इस कारण से, प्रत्येक नमूने में सेल चक्र के लिए एकल सेल जनसंख्या गेट और क्वाड गेट को संशोधित करना आवश्यक हो सकता है। यह इस प्रकार किया जाएगा: समूह के नाम पर डबल क्लिक करें, और समूह संपत्तियों से सिंक्रोनाइजेशन को हटा दें। यह ऑपरेशन समूह के अन्य सभी नमूनों में एक ही फाटक को संशोधित किए बिना एक नमूने में फाटकों के संशोधन की अनुमति देता है। सिंक्रोनाइजेशन हटाने के बाद, जहां आवश्यक हो, फाटकों को संशोधित करें। इस विश्लेषण द्वारा प्राप्त परिणामों की कल्पना करने के लिए, इसे खोलने के लिए कार्यक्षेत्र रिबन अनुभाग में लेआउट एडिटर पर क्लिक करें। लेआउट एडिटर को सैंपल फलक में गेटिंग स्ट्रैटजी के हर गेट को खींचें और गेटिंग स्ट्रैटजी के सीक्वेंस के हिसाब से प्लॉट्स रखें । यदि आवश्यक हो, तो लेआउट में संबंधित भूखंड पर डबल क्लिक करके ग्राफ प्रकार बदलें और ग्राफ परिभाषा विंडो में उपयुक्त प्रकार का चयन करें। समूह पर क्लिक करें और प्रत्येक अंग में प्राप्त परिणामों की कल्पना करने के लिए लेआउट रिबन पर कार्यों द्वारा फिर से शुरू करें, और विभिन्न नमूनों की तुलना करें।