Protokollen beskriver organotypiske explants af mus neuronethinden, dyrket sammen med sin nethinde pigment epitel (RPE), i R16 defineret medium, fri for serum og antibiotika. Denne metode er relativt enkel at udføre, billigere og tidskrævende sammenlignet med in vivo-eksperimenter og kan tilpasses til adskillige eksperimentelle applikationer.
I oftalmisk forskning er der et stærkt behov for in vitro-modeller af neuroretinaen. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for organotypisk dyrkning af musens neuronethinde med intakt nethinde pigment epitel (RPE). Afhængigt af forskningsspørgsmålet kan nethinder isoleres fra vilde dyr eller fra sygdomsmodeller for at studere for eksempel diabetisk retinopati eller arvelig nethindedegeneration. Øjne fra tidlige postnatale dag 2-9 dyr er belyst under aseptiske forhold. De fordøjes delvist i proteinase K for at give mulighed for en løsrivelse af choroiden fra RPE. Under stereoskopet laves et lille snit i hornhinden, hvilket skaber to kanter, hvorfra choroid og sclera forsigtigt kan skrælles af fra RPE og neuroretina. Linsen fjernes derefter, og øjestykket skæres i fire punkter for at give det en fire-kilet form, der ligner et kløverblad. Vævet er endelig overført i en hængende dråbe i en celle kultur indsætte i besiddelse af en polycarbonat dyrkning membran. Kulturerne opretholdes derefter i R16 medium, uden serum eller antibiotika, under helt definerede forhold, med en medium ændring hver anden dag.
Den beskrevne procedure gør det muligt at isolere nethinden og bevare dens normale fysiologiske og histotypiske kontekst til dyrkning af perioder på mindst 2 uger. Disse funktioner gør organotypiske retinale explantkulturer til en fremragende model med høj prædiktiv værdi til undersøgelser af nethindeudvikling, sygdomsmekanismer og elektrofysiologi, samtidig med at farmakologisk screening muliggøres.
I oftalmisk forskning er der en række modeller til rådighed til at studere nethinden, herunder primære nethindecellekulturer, nethinde-afledte cellelinjer, nethindeorganoider og in vivo dyremodeller1,2,3,4,5. Hver af disse modeller lider dog af ulemper. For eksempel vokser celler isoleret, mens nethinden er et komplekst netværk med et væld af celle-til-celle-interaktioner. Således vil adfærden af isolerede cellekulturer sandsynligvis være kunstig sammenlignet med den, der observeres i et helt væv. Dette problem kan til dels afhjælpes ved hjælp af in vitro differentierede nethindeorganoider, som kan bruges til at studere udvikling og grundlæggende biologi6. Men fra i dag, nethinde organoid generation stadig er tidskrævende, arbejdskrævende, og lider af reproducerbarhed spørgsmål, der kræver betydelige yderligere udviklingsarbejde, før organoider kan bruges til translationel nethinde forskning. Endelig er undersøgelser af levende dyr, selv om de velsagtens er den model, der kommer tættest på kravene til oftalmisk forskning, forbundet med stærke etiske bekymringer. Et godt kompromis mellem effektiviteten af cellekultursystemer og den virkelige situation med in vivo dyremodeller er organotypiske nethinde explant kulturer. Sådanne kulturer reducerer også dyrenes lidelser, da der ikke udføres in vivo-interventioner.
Flere metoder er blevet beskrevet til dyrkning af nethinde explants fra forskellige arter5,7,8. Vores protokol beskriver en teknik til isolering af musen neuroretina sammen med sin nethinde pigment epitel (RPE). Denne teknik vil også være egnet til rotte nethindekulturer9. Kulturen i neuroretina sammen med sin RPE er af stor betydning for succes. RPE udfører væsentlige funktioner til nethinden: transport af næringsstoffer, ioner, vand, absorption af lys og beskyttelse mod fotooxidation, re-isomerisering af alt-trans-nethinde til 11-cis-retinal, hvilket er afgørende for den visuelle cyklus, fagagocytose af kaste fotoreceptormembraner og udskillelse af væsentlige faktorer for nethindens strukturelle integritet10. Vedligeholdelse af RPE giver mulighed for en vellykket udvikling af fotoreceptor ydre og indre segmenter, holde nethinden levedygtig i længere tid11. Den nedenfor beskrevne procedure bevarer nethindens histotypiske og fysiologiske egenskaber i mindst to uger12. Desuden undgår dyrkning af de organotypiske nethinde explants i serumfri, antibiotikafri medium tilstedeværelsen af ukendte stoffer og muliggør en enkel fortolkning af resultaterne12.
Organotypiske nethinde explant kulturer har været afgørende for at forbedre vores viden om nethindeudvikling og degeneration7,13,14. Vi viser her, at de også er et nyttigt redskab til farmakologisk screening, og at de kan anvendes til at modellere en række nethindesygdomme, herunder diabetisk retinopati.
Den fremlagte protokol beskriver organotypiske explant kulturer mus nethinden med intakt RPE i defineret R16 medium, fri for serum og antibiotika. Denne protokol blev oprindeligt udviklet fra slutningen af 1980’erne7,28 og siden da er den løbende blevet raffineret6,11,12. Bemærkelsesværdige anvendelser omfatter undersøgelser af mekanismerne for arvelig retinale degeneration og identifikation af retinobeskyttende lægemidler23,29,30.
For et vellykket eksperiment skal der tages hensyn til nogle vigtige overvejelser. Her er nogle vigtige fejlfindingspunkter, der kan hjælpe med at forbedre kvaliteten af kulturer. For det første kan nethindekulturerne udvise overdreven foldning og/eller rosetdannelse31. Dette kan skyldes at røre nethinden med en pincet under explantationsproceduren. Desuden skal ciliary kroppen fjernes helt fra explant, da dette kan øge nethindefoldning under kulturen. For det andet, under overførslen af nethinden til brøndpladen i en hængende dråbe, hvis nethinden vender membranen den forkerte side ned, skal du holde den i dråben hængende fra pipettespidsen og meget forsigtigt skubbe mediet ind og ud af spidsen (uden at løsne den hængende dråbe) for at vende nethinden rundt. Endelig, hvis RPE forbliver knyttet til sclera og løsner sig fra nethinden, er det sandsynligvis forårsaget af en utilstrækkelig forindning af sclera. Dette problem kan være særlig vigtigt, når man arbejder med øjne fra ældre dyr eller ikke-gnaverarter (f.eks. svin) og kan løses ved at øge proteinase K-koncentrationen.
Gennemførelse af organotypiske nethinde explant kulturer er en kompleks procedure, der kræver tilstrækkelig uddannelse og erfaring. Manglende uddannelse kan føre til variation i kvaliteten af nethinde explants. Af disse grunde er det vigtigt at overvåge og kontrollere levedygtighed og reproducerbarhed, der for eksempel karakteriserer celledødshastigheden med TUNEL-analysen. Brugen af et antibiotisk-fri medium gør nethinde explants sårbare over for forurening af bakterier og svampe. For at minimere denne risiko anbefaler vi, at der udvises særlig omhu for at arbejde under virkelig aseptiske forhold. En anden begrænsning af in vitro retinale dyrkning er forskelle i fysiokemiske miljø sammenlignet med in vivo nethinden (f.eks choroidal og nethinde blodforsyning, ilt og glukose niveauer, intraokulært tryk, sammensætning af glasagtige). Et kontinuerligt perfusionssystem, måske indlejret i en dedikeret bioreaktor32, kunne gøre denne model tættere på in vivo-tilstanden. Desuden vil axotomi af synsnerven under nethindedissektion føre til ganglion celledød, der kan fremkalde stressrespons8. Det anbefales derfor, at explanten overlades til at tilpasse sig dyrkningsbetingelserne i mindst 2 dage in vitro, før den udsættes for en bestemt manipulation eller behandling.
Den beskrevne metode udføres normalt på umodne nethindevæv, som kan overleve godt i 4 uger in vitro7,33. Proceduren kan dog skræddersys til en række applikationer, herunder dyrkning af voksen nethinden. Selv om forskellige offentliggjorte metoder beskriver isoleringen af den voksne nethinde uden sin RPE34,35, gør inkubationen med papainopløsning i op til 1 time ved 37 °C før dissektion det muligt for RPE at forblive fastgjort til nethinden, selv når den stammer fra en voksen mus36.
Det serumfrie medium og det kemisk definerede in vitro-miljø giver mulighed for en helt defineret og reproducerbar manipulation af forsøgsbetingelserne. Derfor er organotypiske nethinde explant kulturer værdifulde værktøjer inden for oftalmologi og neurovidenskab, og er blevet brugt til at studere nethindesygdomme37, nethinden udvikling38,39, nethinde stamcelleterapi40, genetiske modifikationer41, og farmakologisk screening. Som et specifikt eksempel på lægemiddeltest brugte vi her nethindeeksulære explantkulturer til at teste en cGMP analog (CN003), kendt for at reducere fotoreceptorcelledød i dyremodeller for arvelig nethindesygdom23 (Figur 3B). En anden mulig anvendelse af teknikken er beskrevet i figur 3C, som illustrerer , hvordan den præcise kontrol af vævsmiljøet kan udnyttes til at efterligne diabetiske tilstande24. På grund af bevarelsen af vævsarkitekturen i hele dyrkningsperioden er organotypiske nethinde explantkulturer også velegnede til elektrofysiologiske undersøgelser. Neuronal funktionalitet på nethinde explants er blevet undersøgt ved hjælp af patch-clamp optagelse42 og multi-elektrode-array (MEA) optagelse33,43. Sidstnævnte gør det muligt at registrere elektrisk aktivitet af neuronale populationer på samme tid og er blevet udnyttet til at karakterisere fotoreceptor og ganglion cellefunktionalitet under kulturforhold. I et bredere perspektiv kan de organotypiske explantkultursystemer også anvendes i præklinisk forskning, hvor explantkulturer blev brugt til at teste hypotermiens terapeutiske effekt44.
Den organotypiske eksplantkulationsteknik er relativt enkel at udføre og sammenlignes med tilsvarende in vivo-forsøg billigere og tidskrævende og undgår de etiske bekymringer i forbindelse med levende dyreforsøg. Den præcise kontrol over eksperimentelle tilstande og bevarelsen af RPE og vævskompleksitet gør metoden til et værdifuldt værktøj til at forbedre vores viden om nethindefysiologi og patofysiologi og muliggøre adskillige eksperimentelle applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Dette forskningsarbejde modtog finansiel støttefra Den Europæiske Union(trans m.m.; H2020-MSCA-765441), det tyske forskningsråd (DFG; PA1751/8-1, 10-1) og Kina stipendium rådet.
Biotin | Sigma | B4639 | |
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
BSA | Sigma | B4639 | |
CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
FCS | Sigma | F7524 | |
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I6634 | |
L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
Progesteron | Sigma | P8783 | |
Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
R16 | Gibco | 07491252A | |
Retinol | Sigma | R7632 | |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
T3 | Sigma | T6397 | |
Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
Transferrin | Sigma | T1283 | |
Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
Vitamin C | Sigma | A4034 |