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생화학

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

Published: September 22, 2020
doi:
10.3791/61871
,
1Graduate School of Medicine,Ehime University, 2Proteo-Science Center,Ehime University

Summary

이 프로토콜은 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 이중층 투석 방법에 의한 고품질 프로테올리포좀의 생산을 위한 효율적인 무세포 방법을 설명합니다. 이 방법은 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

Abstract

막 단백질은 다양한 세포 과정에서 필수적인 역할을 하며 중요한 기능을 수행합니다. 막 단백질은 모든 약물의 절반 이상을 표적으로 삼기 때문에 약물 발견에서 의학적으로 중요합니다. 막 단백질의 생화학적, 생물물리학적, 구조적 연구와 항체 개발의 걸림돌은 정확한 형태와 활성을 가진 고품질 막 단백질을 대량으로 생산하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 여기에서는 밀 배아 무세포 시스템, 리포좀 및 투석 컵을 사용하여 막 단백질을 효율적으로 합성하고 높은 성공률로 단시간에 정제된 프로테올리포좀을 제조하는 “이중층 투석 방법”에 대해 설명합니다. 막 단백질은 GPCR, 이온 채널, 수송체 및 테트라스파닌과 같은 수 밀리그램만큼 생산될 수 있습니다. 이 무세포 분석법은 고품질 프로테올리포좀을 제조하는 데 드는 시간, 비용 및 노력을 줄이는 데 기여하며 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

Introduction

막 단백질은 진단 및 치료에서 가장 중요한 약물 표적 중 하나입니다. 실제로, 작은 복합 약물 표적의 절반은 막 단백질, 예를 들어 G- 단백질 결합 수용체 (GPCR) 및 이온 채널1입니다. 수년에 걸쳐 연구자들은 막 단백질의구조와 기능을 밝히기 위해 생화학적, 생물물리학적, 구조적 연구를 수행해 왔습니다2,3. 막 단백질에 대한 단일 클론 항체의 개발은 기능적 및 구조적 연구를 가속화하고 치료 및 진단 응용 프로그램 4,5,6,7,8,9를 개발하기 위해 적극적으로 수행됩니다. 이러한 모든 연구는 다량의 고품질 막 단백질을 필요로합니다10. 예를 들어, 항체 발달을 위해서는 자연적인 형태를 가진 수 밀리그램의 정제 된 막 단백질이 필요합니다. X선 결정학에는 훨씬 더 많은 양의 고도로 정제된 막 단백질이 필요합니다. 그러나 막 단백질의 대량 생산은 막 단백질 연구11에서 병목 현상으로 남아 있습니다. 막 단백질은 하나 이상의 막 횡단 나선과 복잡한 구조를 가지며 세포 항상성에서 중요한 역할을합니다. 막 단백질의 이종 과발현은 높은 국소 농도로 축적되는 막 단백질의 응집 또는 세포 신호 경로의 교란과 같은 여러 장애물을 유발합니다. 발현이 성공적이더라도 샘플 준비의 후속 단계도 어려움에 직면합니다. 예를 들어, 프로테올리포좀의 제조에는 막 단백질의 가용화, 정제 및 안정화에 대한 높은 수준의 기술과 전문적인 경험이 필요하며 많은 노력과 시간이 소요됩니다12,13.

다른 한편으로, 최근 수십 년 동안 살아있는 세포14,15,16,17,18을 사용하지 않고 단백질을 생산하기 위해 일부 첨단 기술이 등장했습니다. 무세포 단백질 합성 기술은 시험관에서 번역 반응을 재구성합니다. 세포 발현 시스템이 갖는 제한이 없기 때문에, 무세포 시스템은 발현하기 어렵거나 세포에서 독성을 나타내기 어려운 다양한 단백질을 합성할 가능성이 있다. 정제된 세포 추출물 또는 재구성된 번역 기계는 주형 mRNA, 아미노산 및 에너지원과 혼합되고 재조합 단백질은 짧은 시간 내에 합성됩니다. 막 단백질 합성과 관련하여, 리포좀, 비셀, 나노디스크, 또는 공중합체와 같은 지질 또는 양친매성으로 구성된 일부 종류의 스캐폴드가 무세포 반응에 첨가된다 19,20,21,22,23,24. 합성된 막 단백질은 스캐폴드와 상호작용하고 물에서 안정화될 수 있다. 무세포 합성 막 단백질은 기능 연구 및 항체 생산 25,26,27,28,29,30,31에 널리 사용된다.

이 프로토콜에서, 우리는 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 프로테올리포좀 생산의 효율적인 무세포 방법을 설명한다. 밀 무세포 단백질 합성 시스템은 밀 배아15,32,33에서 추출한 추출물을 사용하는 강력한 시험관 내 번역 시스템입니다. 밀 배아는 많은 양의 번역 기계와 번역 억제제를 거의 포함하지 않습니다. 진핵생물의 구성원인 밀의 번역 기계는 진핵 단백질을 번역하는 데 적합하며, 그 번역 효율은 주형 mRNA의 코돈 사용에 거의 영향을 받지 않습니다. 밀 무 세포 시스템을 사용하여 단백질 키나아제 34,35, 유비퀴틴 리가 아제36, 전사 인자37 및 성공률이 높은 막 단백질을 포함한 다양한 단백질을 합성했습니다. 막 단백질 생산을 위해, 우리는 스캐폴드19,38로서 번역 혼합물에 지질 소포 리포좀을 첨가한다. 막 단백질의 소수성 도메인은 지질 이중층과 상호 작용하며 리포솜과 자발적으로 통합됩니다. 밀도 구배 원심분리는 번역 반응 혼합물의 일반적인 원심분리가 프로테올리포솜(20)의 단순 정제에 충분함에도 불구하고 내인성 밀 단백질로부터 프로테올리포좀을 엄격하게 분리하는 데 사용됩니다. 많은 종류의 일체형 막 단백질이 밀 무 세포 시스템을 사용하여 합성되었으며 다양한 연구 및 개발 25,38,39,40,41,42,43,44에 적용되었습니다. 또한, 우리는 대규모 생산45,46을위한 “이중층 투석 방법”을 개발했습니다. 이 방법에서는 컵형 투석 장치를 기질 공급 완충액에 침지하고, 그림 1과 같이 컵에 2층의 번역 반응 혼합물과 기질 공급 완충액을 형성한다. 기질의 지속적인 공급 및 부산물 제거는 반응 혼합물의 상단과 하단 모두에서 장시간 효율적으로 수행될 수 있어 우수한 번역 효능을 제공합니다(그림 2A 및 그림 2B)45.

Protocol

1. pEU 발현 플라스미드의 제조 참고: pEU 발현 플라스미드는 단편에서 시작 코돈, 표적 막 단백질의 개방 판독 프레임 및 정지 코돈을 포함해야 합니다( 그림 1 참조). 필요한 경우 적절한 위치에 검출/정제 태그 시퀀스를 추가합니다. 제한 효소 소화 또는 원활한 클로닝은 서브클로닝에 적용할 수 있습니다. 여기서는 원활한 복제 방법을 사용하는 프로토콜?…

Representative Results

이 프로토콜을 사용하면 부분적으로 정제 된 프로테올리포좀을 짧은 시간 내에 얻을 수 있습니다. 대표적인 결과를 도 2A에 나타내었다. 클래스 A, B 및 C의 25 개의 GPCR을 이중층 투석 방법 (소규모)을 사용하여 성공적으로 합성하고 원심 분리 및 완충액 세척에 의해 부분적으로 정제했습니다. 합성된 단백질의 양은 단백질의 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 대형 투석 컵을 …

Discussion

제시된 프로토콜은 높은 성공률로 막 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 간단하고 재현성이 높으며 확장하기 쉽습니다. 또한 많은 양의 막 단백질을 소비하는 실험의 시간과 비용을 줄일 수 있는 잠재력이 있습니다. 이중층 투석 방법은 이중층 방법 또는 투석 방법에 비해 생산성을 4-10배 향상시킵니다(그림 2B)45. 극단적 인 경우, 이온 채?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 보조금 번호 JP20am0101077에 따라 AMED의 약물 발견 및 생명 과학 연구 지원을 위한 플랫폼 프로젝트(혁신적인 약물 발견 및 생명 과학 연구(BINDS) 지원을 위한 기반)의 지원을 받았습니다. 이 작업은 JSPS KAKENHI 보조금 번호 20K05709에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

Materials

×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240
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Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).
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