Denne undersøgelse havde til formål at præsentere en strategi for at identificere stof-peptid interaktioner. Strategien omfatter biopanning af lægemiddelanerkendende korte peptider baseret på en kvarts-krystal mikrobalance (QCM) biosensor, efterfulgt af bioinformatikanalyse til kvantitativ vurdering af de oplysninger, der er opnået til lægemiddelgenkendelse og anmærkning af de narkotikabindende steder på proteiner.
Receptorer og enzymproteiner er vigtige biomolekyler, der fungerer som bindende mål for bioaktive små molekyler. Den hurtige og globale validering af interaktioner mellem lægemidler og proteiner er således meget ønskelig, fordi man ikke blot forstår de molekylære mekanismer, der ligger til grund for den terapeutiske virkning, men også for at vurdere lægemiddelegenskaber, såsom adsorption, distribution, metabolisme, udskillelse og toksicitet (ADMET) til klinisk brug. Her præsenterer vi en biosensorbaseret høj gennemløbsstrategi for biopanning af T7 phage-displayede korte peptider, der let kan vises på phage capsid. Efterfølgende analyse af aminosyresekvenserne af peptider, der indeholder korte segmenter, som “brudte relikvier”, af de stofbindende steder ved hjælp af bioinformatikprogrammer i receptor ligand kontakt (RELIC) suite, er også vist. Ved at anvende denne metode til to klinisk godkendte lægemidler, en anti-tumor irinotecan, og en anti-influenza oseltamivir, den detaljerede proces for indsamling af narkotika-anerkendende peptid sekvenser og fremhæve narkotika-bindende steder af målet proteiner er forklaret i dette papir. Den strategi, der er beskrevet heri, kan anvendes til alle små molekyler af interesse.
Identifikation af narkotikabindende mål er afgørende for udviklingen af lægemidler og for forståelsen af sygdommes molekylære mekanismer. Især receptor- og enzymproteiner er de vigtigste molekylære mål for bioaktive små molekyler1. Selvom affinitetsfangst er en veletableret teknik til identifikation af de narkotikabindende proteiner2, hæmmer tekniske begrænsninger, såsom proteiners lave opløselighed, ofte valideringen af lægemiddelmål2. Vigtigst af alt mister de immobiliserede små molekyler den grad af frihed, der er nødvendig for docking og kan være utilgængelig for de internt placerede bindingssteder på større målproteiner. Desuden hæmmer proteinfejl, manglende evne til at analysere co-krystalliseringsbetingelser og begrænsninger på grund af molekylær størrelse ofte brugen af røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) og andre sådanne eksperimentelle analyser til undersøgelse af lægemiddelproteininteraktioner.
Brugen af T7 phage display biopanning er en effektiv måde at bestemme bindingsstedet på proteiner til små molekyle lokkemad3. Især en T7 phage-displayet tilfældig peptid bibliotek, som kan konstrueres ved at indsætte syntetisk DNA i en multi-kloning site, er effektiv. Sammenlignet med T7 phage biblioteket viser proteiner, de korte peptider kan let manipuleres til at blive vist på T7 phage capsid uden fysiske begrænsninger, som kan sterisk kontakt med enhver lille molekyle stof fastgjort på en solid støtte2. Desuden giver indførelsen af en kvarts-krystal mikrobalance (QCM) biosensor i T7 phage display biopanning platform identifikation af sådanne svage, men specifikke interaktioner af korte peptider med lægemidler ved at overvåge reduktionen i QCM frekvens4,5. Den bundne T7-phage genvindes derefter direkte ved at inficere værten Escherichia coli (BLT5615), og DNA-sekvensen i den region, der koder den affinitetsvalgte peptid, der huser stofgenkendelse af korte segmenter, bestemmes. Efterfølgende analyse af aminosyresekvensen af peptidpopulationen giver oplysninger om lægemiddelgenkendelse. I silico pairwise tilpasning af de reddede aminosyre sekvenser kan bruges til at indhente oplysninger om det biologiske mål for lægemidlet inden for en udvalgt proteom. Denne høje gennemstrømning identifikation af protein fragmenter med affinitet over for et lægemiddel kan bruges til heuristisk rekonstruere narkotika-bindende site på en måde, der svarer til at rekonstruere en gammel artefakt fra keramik skår6. Især kan denne unikke tilgang være nyttig, når konventionelle proteomics tilgange mislykkes.
Her præsenterer vi en biosensorbaseret strategi for biopanning af T7 phage-displayede peptider og bioinformatikanalyse til målvalidering af de små molekyler. Ud over tekniske begrænsninger for konventionelle metoder gør denne strategi det muligt at identificere narkotikabindende steder på målproteiner for ethvert lille molekyle af interesse under den identiske protokol.
Her er der fremlagt en strategi for QCM biosensorbaseret biopanning af lægemiddelincitificerende peptider efterfulgt af bioinformatikanalyse til validering af lægemiddelproteininteraktioner ved hjælp af de identificerede peptider. Design af de små molekylederivater til immobilisering på biosensorens guldelektrode er et vigtigt skridt, da den introducerede linker kan hindre bindingen og samlingen af peptid, der genkender stoffet. For at undgå dette udarbejdes derivater med forskellige positioner af den indførte linker23. Alternativt, for immobilisering hydrofobe små molekyler, sensoren chip er nedsænket i bulk vand i en 10 cm Petri parabol, og en 20 μL opløsning af det lille molekyle (10 mM opløsning i dimethyl sulfoxid) er faldet på guld elektrode af biosensor, til at dække sin overflade, og inkuberes i 5 min. Dette gør det muligt at fastholde en sub-hundrede hertz iboende frekvens af små molekyler, som holdes i mindst 10 minutter under biopanning. Ved hjælp af en sådan immobilisering fremhævede osel-affinitetsvalgte peptider klart det Osel-bindende sted i NA (figur 3).
Den T7 phage bruges til at forberede peptid biblioteket her er genetisk manipuleret ved hjælp af NNK15 kassette, der koder 32 codons for alle 20 af standard aminosyrer og undertrykker fremkomsten af 2 stop codons (UAA, UGA) og viser kun UAG (Figur 1)6,7. Dette er vigtigt for at vise 15-mer peptider i fuld længde og øge bibliotekets mangfoldighed. T7 phage display system har en teknisk display grænse på 107-109 T7 phages. Mangfoldigheden i det 15-mer peptidbibliotek er imidlertid teoretisk set 2015 (3,27 × 1019); Den kan derfor ikke bruges til komplet bibliotekskonstruktion. Ikke desto mindre gør lighedssøgning eller minedrift af bevarede motiver det muligt at detektere aminosyrerne, der omfatter proteiners stofbindende steder, selv med denne begrænsede mangfoldighed af peptider i biblioteket. Derudover strækker 3-5 aminosyrer sig inden for bibliotekets peptid (udseendehastigheden er mellem 1/203 og 1/ 205, som kan realiseres ved hjælp af T7 phage display system) er involveret i anerkendelsen af små molekylelægemidler; derfor er en 100% match af peptidsekvenserne med 15-mer aminosyresekvenser, der udgør målproteinets stofbindingssted, ikke påkrævet. Faktisk fremhævede ca. 30 affinitetsvalgte peptider med succes målproteinets bindende sted for hvert testet lægemiddel (figur 4). Således kan mangfoldigheden af det anvendte forældre-T7-phagebibliotek (1,7 ×10 7 pfu/mL) bruges til heuristisk at rekonstruere det narkotikabindende sted.
Typisk opstod 3-5 kopier af T7-phages, der viste de samme sekvenser som dem i de 15-mer aminosyresekvenser, der huser stofinficerende aminosyrestrækninger, inden for de 16 plaques vilkårligt isoleret, hvilket indikerer succesen med affinitetsvalget under vores protokol. Dette indikerer, at der indsamles 18-30 forskellige stofintificerende peptidsekvenser inden for de 96 isolerede plaques (tallet er forbundet med mikropladeformatet), som identificeres efterfølgende ved hjælp af sekventering af DNA’et og opnåelse af den tilsvarende aminosyresekvens. I den nuværende strategi er injektion af 8 μL af T7 phage biblioteket i cuvette indeholdende 8 mL buffer (1000 gange fortynding af biblioteket) egnet til at reducere den ikke-specifikke binding af T7 phages. For at øge mangfoldigheden af de affinitetsvalgte peptider viste det sig at være mere effektivt end isolation fra en enkelt opløsning ad gangen at gentage valg af en cyklus flere gange og bruge 16 eller 32 plakisolationer pr. screening. For eksempel, for effektivt at indsamle ca. 30 forskelligt sekventerede affinitetsvalgte peptider, blev der udført 3-6 sæt valg af en cyklus, 16 eller 32 plaques blev isoleret i hvert eksperiment. Udseende af identiske sekvenser i alle 16 eller 32 T7 phage plaques er angivet utilsigtet påvisning af baggrund eller kan kontaminere som en overførsel. I modsætning hertil indikerer fraværet af T7-phages med samme rækkefølge eller udseende af mange T7-phages med kortere peptider end 15-mer-længden, at T7-phages i populationen ikke-specifikt opstod med høj sandsynlighed. Da QCM-frekvensreduktion sker i samme omfang, selv i sådanne tilfælde, bør udvælgelsens succes vurderes grundigt ved at sekventere DNA’et for den isolerede T7-phage efterfulgt af bioinformatikanalyse af peptiders aminosyresekvenser. I modsætning til den konventionelle T7 phage displayprotokol er gentagne udvælgelsesrunder mindre effektive, da variationen og antallet af T7-phages er lille og ikke er koncentreret, selv efter at du har gentaget forstærknings- ogudvælgelsestrinnene 23.
Det er vigtigt, at denne metode gælder for udvinding af små molekylebindingssteder i proteomer hos mennesker, patogene vira og endda planter. Interessant nok kan den muligvis ustrukturerede korte displaylængde af peptider på T7 phage capsid efterligne den molekylære dynamik af peptider af proteiner under docking med et lille molekyle; Dette kan afspejle dynamisk binding24. Ud over de tekniske begrænsninger af konventionelle metoder, denne strategi, der gælder for identiske protokoller for små molekyler, kan udvide druggable proteom samt give mere granularitet med hensyn til narkotika-protein interaktion analyse.
Visse tekniske begrænsninger af denne fremgangsmåde bør overvejes. Organisk syntese er nødvendig for små molekyle immobilisering på guld elektrode overfladen af biosensor chip. For ikke-eksperter i organisk kemi er nogle immobiliseringsreagenser kommercielt tilgængelige for mekanisk at fikse det lille molekyle ved kobling. Desuden kan visse nonsens dele af peptider resultere i påvisning af en del af proteinet ikke er relevante for narkotika docking som falske positiver. Dette svarer empirisk til beta-ark eller leucin-rige domæner rig på leucin eller valine rester, som er kodet af flere codons end andre standard aminosyrer, når kopier af T7 phage produceres. Styring af bibliotekets peptidlængde kan styre forekomsten af falske positiver. I modsætning hertil kan der være tilfælde, hvor aminosyrerester på det stofbindende sted, der er involveret i docking, som påvist ved hjælp af røntgenkrystallografi eller NMR-analyse, ikke opdages. Dette kan løses ved at indsamle et større antal af de stof-genkendelse peptider eller ændre retningen af fastsættelse af de små molekyler på guld elektroden.
Mange interaktioner mellem stoffer og proteiner, der er relateret til de vigtigste og sekundære virkninger af stofbrug, kan endnu ikke identificeres i proteomet; Desuden kan enzymer og transportører, der er ansvarlige for absorption af lægemidler, distribution, metabolisme, udskillelse og toksicitet, også stadig være uidentificerede. Proteinbinding er ikke altid ansvarlig for et lægemiddels bioaktivitet. Således vil en kombination af andre oplysninger fra biologiske assays forbedre identifikationen af væsentlige narkotika mål ansvarlig for de vigtigste og negative virkninger af narkotika. Yderligere tilpasninger af denne koncise teknik vil øge det praktiske og gennemløb for minedrift af proteinbindende steder af en bred vifte af små molekylelægemidler. Den metode, der præsenteres heri, vil i vid udstrækning bidrage til ikke blot at udføre grundforskning på de relaterede områder, men også afklare de molekylære mekanismer, der ligger til grund for terapeutisk effekt eller andre biologiske virkninger af lægemidler til klinisk brug.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren takker Drs. Yujiro Hayashi og Hayato Ishikawa for at give oseltamivir, og Dr. Lee Makowski for at give stand-alone RELIC programmer. Forfatteren anerkender også Tetsuya Kawagoe for teknisk bistand fra QCM eksperimentet. Dette arbejde blev delvist støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.).
ERKLÆRING OM DATATILGÆNGELIGHED
De enkeltstående RELIC-programmer og sekvensdataene for affinitetsvalgte peptider for lægemidler samt proteinsekvenserne fra proteomdatabasen, der bruges i dette papir, er tilgængelige fra denne forfatter efter anmodning (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
Liguid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
Recptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |