Charakterisierung und funktionelle Vorhersage von Bakterien im Eierstockgewebe
Summary
Immunhistochemische Färbung und 16S ribosomale RNA-Gensequenzierung (16S rRNA-Gen) wurden durchgeführt, um Bakterien in krebsartigen und nicht krebsartigen Eierstockgeweben in situ zu entdecken und zu unterscheiden. Die kompositorischen und funktionellen Unterschiede der Bakterien wurden mit Hilfe von BugBase und Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) vorhergesagt.
Abstract
Die Theorie eines “sterilen” weiblichen oberen Fortpflanzungstraktes stößt aufgrund von Fortschritten beim Bakteriennachweis auf zunehmenden Widerstand. Ob Eierstöcke Bakterien enthalten, ist jedoch noch nicht bestätigt. Hierin wurde ein Experiment zum Nachweis von Bakterien im Eierstockgewebe eingeführt. Wir wählten Eierstockkrebspatientinnen in der Krebsgruppe und nicht-krebserregende Patientinnen in der Kontrollgruppe aus. Die 16S rRNA-Gensequenzierung wurde verwendet, um Bakterien im Eierstockgewebe von den Krebs- und Kontrollgruppen zu unterscheiden. Darüber hinaus haben wir die funktionelle Zusammensetzung der identifizierten Bakterien mitHilfe von BugBase und PICRUSt vorhergesagt. Diese Methode kann auch in anderen Eingeweiden und Geweben eingesetzt werden, da in den letzten Jahren nachgewiesen wurde, dass viele Organe Bakterien beherbergen. Das Vorhandensein von Bakterien in Eingeweiden und Geweben kann Wissenschaftlern helfen, krebshaftes und normales Gewebe zu bewerten und kann bei der Behandlung von Krebs helfen.
Introduction
In letzter Zeit wurde eine zunehmende Anzahl von Artikeln veröffentlicht, die die Existenz von Bakterien in abdominalen festen Eingeweiden wie Niere, Milz, Leber und Eierstockbelegen 1,2. Geller et al. fanden Bakterien in Pankreastumoren, und diese Bakterien waren resistent gegen Gemcitabin, ein Chemotherapeutikum2. S. Manfredo Vieira et al. kamen zu dem Schluss, dass Enterococcus gallinarum auf die Lymphknoten, Leber und Milz übertragbar ist und die Autoimmunität antreiben kann3.
Da der Gebärmutterhals eine Rolle als Verteidiger spielt, sind Bakterien im oberen weiblichen Fortpflanzungstrakt, der Gebärmutter, Eileiter und Eierstöcke enthält, nur minimal erforscht. In den letzten Jahren haben sich jedoch einige neue Theorien etabliert. Bakterien können während des Menstruationszyklus aufgrund von Veränderungen der Schleimhäute Zugang zur Gebärmutterhöhle haben4,5. Darüber hinaus bestätigten Zervomanolakis et al., dass der Uterus zusammen mit den Eileitern eine Peristaltikpumpe ist, die vom endokrinen System der Eierstöcke gesteuert wird, und diese Anordnung ermöglicht es Bakterien, in das Endometrium, die Eileiter und die Eierstöcke einzudringen6.
Der obere Fortpflanzungstrakt ist dank der Entwicklung bakterieller Nachweismethoden kein Rätsel mehr. Verstraelen et al. verwendeten eine barcoded paired-end Sequenzierungsmethode, um Uterusbakterien zu entdecken, indem sie auf die hypervariable V1-2-Region des 16S-RNA-Gens7abzielten. Fang et al. verwendeten barcoded sequencing bei Patienten mit Endometriumpolypen und zeigten das Vorhandensein verschiedener intrauteriner Bakterien8. Darüber hinaus fanden Miles et al. und Chen et al. unter Verwendung des 16S-RNA-Gens Bakterien im Genitalsystem von Frauen, die sich einer Salpingo-Oophorektomie und Hysterektomie unterzogen hatten, bzw.5,9.
Bakterien im Tumorgewebe haben in den letzten Jahren zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen. Banerjee et al. entdeckten, dass sich die Mikrobiomsignatur zwischen Eierstockkrebspatientinnen und Kontrollpersonen unterschied10. EinNoxynatronum sibiricum war mit dem Tumorstadium assoziiert, und Methanosarcina vacuolata könnte verwendet werden, um Eierstockkrebs zu diagnostizieren11. Neben Eierstockkrebs wurden andere Krebsarten wie Magen, Lunge, Prostata, Brust, Gebärmutterhals und Endometrium nachweislich mit Bakterienassoziiert 12 , 13,14,15,16,17,18. Poore et al. schlugen eine neue Klasse mikrobiell basierter onkologischer Diagnostik vor, die ein Krebsfrüherkennung im Frühstadium vorsieht19. In diesem Protokoll untersuchten wir die Unterschiede zwischen krebsösen und normalen Eierstockgeweben, indem wir die Zusammensetzung und Funktion von Bakterien in diesen beiden Geweben verglichen.
Immunhistochemische Färbung und 16S rRNA-Gensequenzierung wurden durchgeführt, um das Vorhandensein von Bakterien in den Eierstöcken zu bestätigen. Die Unterschiede und vorhergesagten Funktionen der Ovarialbakterien in krebsartigen und nicht-krebsartigen Eierstockgeweben wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigten die Existenz von Bakterien im Eierstockgewebe. Anoxynatronum sibiricum und Methanosarcina vacuolata waren mit dem Stadium bzw. der Diagnose von Eierstockkrebs verbunden. Sechsundvierzig signifikant unterschiedliche KEGG-Signalwege, die in beiden Gruppen vorhanden waren, wurden verglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eierstockkrebs hat einen bemerkenswerten Einfluss auf die Fruchtbarkeit von Frauen25. Die meisten Eierstockkrebspatientinnen werden in späten Stadien diagnostiziert, und die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt weniger als 30%18. Die Bestätigung von Bakterien in den abdominalen festen Eingeweiden, einschließlich Leber, Bauchspeicheldrüse und Milz, wurde veröffentlicht. Die Existenz von Bakterien im oberen weiblichen Fortpflanzungstrakt tritt auf, weil der Gebärmutterhals…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Clinical Research Award des First Affiliated Hospital der Xi’an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), das Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), das Key Research and Development Project der Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), das Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) und das medizinische Forschungsprojekt des Xi’an Social Development Guidance Plan (2017117SF/ YX011-3). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Wir danken den Kollegen in der Abteilung für Gynäkologie des First Affiliated Hospital der Xi’an Jiaotong University für ihre Beiträge zur Probensammlung.
Materials
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
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| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al. The ovarian cancer oncobiome. Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
