هنا ، نصف منهجية سهلة الاستخدام لإنشاء صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية ذاتية التجميع 3D التي تتكون من الخلايا العضلية القلبية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المتمايزة مسبقا ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية. يمكن تنفيذ هذه التقنية سهلة الاستخدام ومنخفضة الخلايا التي تتطلب تقنية لتوليد الأنسجة الدقيقة القلبية لنمذجة الأمراض والمراحل المبكرة من تطوير الدواء.
وقد وفر توليد الخلايا العضلية القلبية البشرية (CMs) والخلايا الليفية القلبية (CFs) والخلايا البطانية (ECs) من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) فرصة فريدة لدراسة التفاعل المعقد بين أنواع الخلايا القلبية الوعائية المختلفة التي تدفع نمو الأنسجة والمرض. في مجال نماذج الأنسجة القلبية ، تستخدم العديد من الأساليب ثلاثية الأبعاد المتطورة (3D) الخلايا العضلية القلبية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSC-CMs) لمحاكاة الأهمية الفسيولوجية وبيئة الأنسجة الأصلية مع مزيج من المصفوفات خارج الخلية والروابط المتقاطعة. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة معقدة للتصنيع دون خبرة في التصنيع الدقيق وتتطلب عدة أسابيع للتجميع الذاتي. الأهم من ذلك ، أن العديد من هذه الأنظمة تفتقر إلى الخلايا الوعائية والخلايا الليفية القلبية التي تشكل أكثر من 60٪ من الخلايا غير العضلية في قلب الإنسان. هنا نصف اشتقاق جميع أنواع خلايا القلب الثلاثة من iPSCs لتصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية. تسمح تقنية التشكيل المتماثل سهلة هذه بزراعة الأنسجة الدقيقة القلبية في لوحات زراعة الخلايا القياسية متعددة الآبار لعدة أسابيع. تسمح المنصة بالتحكم المحدد من قبل المستخدم في أحجام الأنسجة الدقيقة بناء على كثافة البذر الأولية وتتطلب أقل من 3 أيام للتجميع الذاتي لتحقيق تقلصات الأنسجة الدقيقة القلبية التي يمكن ملاحظتها. علاوة على ذلك ، يمكن هضم الأنسجة الدقيقة القلبية بسهولة مع الحفاظ على صلاحية عالية للخلية للاستجواب أحادي الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). نحن نتصور أن هذا النموذج المختبري للأنسجة الدقيقة القلبية سيساعد على تسريع دراسات التحقق من الصحة في اكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض.
يواجه اكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية العديد من التحديات بسبب نقص العينات ذات الصلة سريريا وعدم كفاية الأدوات الانتقالية1. لا تظهر النماذج ما قبل السريرية شديدة التعقيد أو النماذج أحادية الخلية المبسطة في المختبر ظروفا فسيولوجية مرضية بطريقة قابلة للتكرار. لذلك ، تطورت العديد من المنصات المصغرة التي تم هندستها بالأنسجة للمساعدة في سد الفجوة ، بهدف تحقيق توازن بين سهولة التطبيق بطريقة عالية الإنتاجية والتلخيص الأمين لوظيفة الأنسجة 2,3. مع ظهور تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ، يمكن تطبيق أدوات هندسة الأنسجة على الخلايا الخاصة بالمريض مع أو بدون حالة أمراض القلب والأوعية الدموية الكامنة للإجابة على أسئلة البحث4،5،6. يمكن استخدام مثل هذه النماذج الهندسية للأنسجة ذات التركيب الخلوي المشابه لأنسجة القلب في جهود تطوير الأدوية لاختبار سمية القلب والخلل الوظيفي الناجم عن التغيرات المرضية في سلوك نوع واحد أو عدة خلايا.
الأنسجة الدقيقة ذاتية التجميع أو الأعضاء المشتقة من iPSCs البشرية هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) عبارة عن تجمعات مصغرة تشبه الأنسجة تظهر أوجه تشابه وظيفية مع نظيراتها في الجسم الحي. هناك العديد من الأساليب المختلفة التي تسمح بتكوين المواد العضوية في الموقع عن طريق التمايز الموجه ل iPSCs أو من خلال تكوين الأجسام الجنينية4. المواد العضوية الناتجة هي أداة لا غنى عنها لدراسة العمليات المورفوجينية التي تدفع التكوين العضوي. ومع ذلك، فإن وجود مجموعة متنوعة من مجموعات الخلايا والاختلافات في التنظيم الذاتي يمكن أن يؤدي إلى تباين في النتائج بين المواد العضوية المختلفة5. بدلا من ذلك ، تعد الخلايا المتمايزة مسبقا التي يتم تجميعها ذاتيا في أنسجة دقيقة ذات أنواع خلايا خاصة بالأنسجة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية المحلية نماذج ممتازة ، حيث يكون من الممكن عزل المكونات المجمعة ذاتيا. خاصة في أبحاث القلب البشري ، أثبت تطوير الأنسجة الدقيقة القلبية 3D ذات المكونات متعددة الخلايا أنه يمثل تحديا عندما يتم اشتقاق الخلايا من خطوط مختلفة للمرضى أو مصادر تجارية.
لتحسين فهمنا الميكانيكي لسلوكيات الخلايا في نموذج ذو صلة فسيولوجية وشخصية ومختبرية ، من الناحية المثالية ، يجب اشتقاق جميع أنواع الخلايا المكونة من نفس خط المريض. في سياق القلب البشري ، فإن نموذج القلب التمثيلي الحقيقي في المختبر من شأنه أن يلتقط الحديث المتبادل بين أنواع الخلايا السائدة ، وهي الخلايا العضلية القلبية (CMs) ، والخلايا البطانية (ECs) ، والخلايا الليفية القلبية (CFs) 6,7. لا يتطلب التلخيص الأمين لعضلة القلب التمدد الفيزيائي الحيوي والتحفيز الكهروفسيولوجي فحسب ، بل يتطلب أيضا إشارات الخلايا الخلوية التي تنشأ عن أنواع الخلايا الداعمة مثل ECs و CFs8. تشارك CFs في تخليق المصفوفة خارج الخلية والحفاظ على بنية الأنسجة. وفي حالة مرضية ، يمكن أن تحفز CFs التليف وتغير التوصيل الكهربائي في CMs9. وبالمثل ، يمكن لل ECs تنظيم الخصائص الانقباضية ل CMs من خلال إشارات paracrine وتوفير متطلبات التمثيل الغذائي الحيوية 10. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أنسجة القلب الدقيقة البشرية المكونة من جميع أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة للسماح بإجراء تجارب عالية الإنتاجية ذات صلة فسيولوجية.
هنا ، نصف نهجا من أسفل إلى أعلى في تصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية عن طريق اشتقاق الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية (iPSC-CMs) ، والخلايا البطانية المشتقة من iPSC (iPSC-ECs) ، والخلايا الليفية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CFs) وثقافتها 3D في صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية الموحدة. يمكن استخدام هذه الطريقة السهلة لتوليد الأنسجة الدقيقة القلبية التي تنبض تلقائيا لنمذجة الأمراض والاختبار السريع للأدوية من أجل الفهم الوظيفي والميكانيكي لفسيولوجيا القلب. علاوة على ذلك ، يمكن استغلال منصات الأنسجة الدقيقة القلبية متعددة الخلايا هذه بتقنيات تحرير الجينوم لمحاكاة تطور أمراض القلب بمرور الوقت في ظل ظروف الثقافة المزمنة أو الحادة.
لتوليد أنسجة دقيقة للقلب من iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs المتمايزة مسبقا ، من الضروري الحصول على ثقافة نقية للغاية للتحكم بشكل أفضل في أعداد الخلايا بعد ضغط الخلايا المثبط للاتصال داخل الأنسجة الدقيقة القلبية. في الآونة الأخيرة ، جياكوميلي وآخرون. وقد أثبتت al.18 تصنيع الأنسجة الدقيقة ال…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتورة أماندا تشيس على ملاحظاتها المفيدة على المخطوطة. وقدم الدعم التمويلي برنامج بحوث الأمراض المتصلة بالتبغ التابع لجامعة كاليفورنيا، T29FT0380 (D.T) و 27IR-0012 (J.C.W.)؛ جمعية القلب الأمريكية 20POST35210896 (H.K.) و 17MERIT33610009 (J.C.W.) ؛ والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL126527 و R01 HL123968 و R01 HL150693 و R01 HL141851 و NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |