عزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وجزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية الحشوية البشرية المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي والتنميط الظاهري للبلاعم
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لهضم الكولاجين لعزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وخلايا جزء الأوعية الدموية اللحمية من الدهون الحشوية البشرية في عملية واحدة ، بما في ذلك منهجية الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا الشحمية والتنميط الظاهري لبلاعم SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
Abstract
الأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) هي عضو استقلابي نشط يتكون أساسا من الخلايا الشحمية الناضجة وخلايا الجزء الوعائي اللحمي (SVF) ، والتي تطلق جزيئات نشطة بيولوجيا مختلفة تتحكم في العمليات الأيضية والهرمونية والمناعية. حاليا ، من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العمليات داخل الأنسجة الدهنية. لذلك ، فإن تطوير طرق تقييم مساهمة كل مجموعة خلايا في الفيزيولوجيا المرضية للأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية. يصف هذا البروتوكول خطوات العزل ويوفر إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها اللازمة للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة و SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز. علاوة على ذلك ، تم تحسين البروتوكول أيضا لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم وإجراء عزل الحمض النووي الريبي للخلايا الشحمية الناضجة لدراسات التعبير الجيني ، مما يسمح بإجراء دراسات تشريح التفاعل بين مجموعات الخلايا هذه. باختصار ، يتم غسل خزعات ضريبة القيمة المضافة ، وفرمها ميكانيكيا ، وهضمها لتوليد تعليق أحادي الخلية. بعد الطرد المركزي ، يتم عزل الخلايا الشحمية الناضجة عن طريق التعويم من حبيبات SVF. يضمن بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي إنتاجية عالية من إجمالي الحمض النووي الريبي (بما في ذلك miRNAs) من الخلايا الشحمية لمقايسات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، يتم استخدام خلايا SVF لتوصيف مجموعات فرعية من البلاعم (النمط الظاهري المؤيد والمضاد للالتهابات) من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.
Introduction
لا تتكون الأنسجة الدهنية البيضاء من الخلايا الدهنية أو الخلايا الشحمية فحسب ، بل تتكون أيضا من جزء من الخلايا غير الدهنية يعرف باسم جزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، والذي يحتوي على مجموعة خلايا غير متجانسة تتكون من الضامة ، والخلايا المناعية الأخرى كخلايا تائية تنظيمية (Tregs) ، وحمضات ، وخلايا preadipocytes ، وخلايا ليفية ، محاطة بأنسجة وعائية وضامة 1,2. تعتبر الأنسجة الدهنية (AT) الآن عضوا ينظم العمليات الفسيولوجية المتعلقة بالتمثيل الغذائي والالتهاب من خلال الأديبوكينات والسيتوكينات والحمض النووي الريبي الدقيق الذي تنتجه وتطلقه خلايا مختلفة في الأنسجة ، مع تأثيرات autocrine و paracrine والغدد الصماء 3,4. في البشر ، تشتمل الأنسجة الدهنية البيضاء على الأنسجة الدهنية تحت الجلد (SAT) والأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) ، مع اختلافات تشريحية وجزيئية وخلوية وفسيولوجية مهمة بينهما 2,5. يمثل SAT ما يصل إلى 80٪ من ATالبشري ، بينما تقع ضريبة القيمة المضافة داخل تجويف البطن ، بشكل رئيسي في المساريق والثرب ، كونها أكثر نشاطا من الناحية الأيضية6. علاوة على ذلك ، فإن ضريبة القيمة المضافة هي عضو في الغدد الصماء يفرز وسطاء لهم تأثير كبير على وزن الجسم وحساسية الأنسولين واستقلاب الدهون والالتهابات. وبالتالي ، يؤدي تراكم ضريبة القيمة المضافة إلى السمنة في منطقة البطن والأمراض المرتبطة بالسمنة مثل مرض السكري من النوع 2 ، ومتلازمة التمثيل الغذائي ، وارتفاع ضغط الدم ، ومخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية ، مما يمثل مؤشرا أفضل للوفيات المرتبطة بالسمنة6،7،8،9.
في ظروف الاستتباب ، تتعاون الخلايا الشحمية والبلاعم والخلايا المناعية الأخرى للحفاظ على استقلاب ضريبة القيمة المضافة من خلال إفراز وسطاء مضادين للالتهابات10. ومع ذلك ، فإن التوسع المفرط في ضريبة القيمة المضافة يعزز تجنيد الخلايا التائية المنشطة والخلايا القاتلة الطبيعية والبلاعم. في الواقع ، في ضريبة القيمة المضافة الخالية من الدهون ، تبلغ نسبة البلاعم 5٪ ، بينما ترتفع هذه النسبة إلى 50٪ في السمنة ، مع استقطاب البلاعم من النمط الظاهري المضاد للالتهابات إلى النمط الظاهري المؤيد للالتهابات ، مما يولد بيئة التهابية مزمنة10,11.
نتيجة لوباء السمنة ، نشأ عدد مذهل من التقارير التي تتناول مواضيع بحثية مختلفة لضريبة القيمة المضافة ، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الدهنية ، وعلم التخلق ، والالتهابات ، وخصائص الغدد الصماء ، والمناطق الناشئة مثل الحويصلات خارج الخلية ، من بين أمور أخرى8،10،12،13. ومع ذلك ، على الرغم من أن بيئة ضريبة القيمة المضافة يتم تعريفها من خلال الحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية والبلاعم المقيمة أو القادمة ، فقد ركزت معظم الدراسات على مجموعة خلايا واحدة فقط ، وهناك معلومات نادرة حول تفاعل هذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة وعواقبها الفسيولوجية المرضية11,14. علاوة على ذلك ، تم إجراء دراسات قيمة تتناول تفاعل الخلايا الشحمية والبلاعم في AT باستخدام خطوط الخلايا ، وتفتقر إلى ظروف التحضير في الجسم الحي 11،14،15. تتطلب الإستراتيجية المناسبة لتشريح التفاعل أو المساهمة الخاصة لهذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة عزل كلا النوعين من الخلايا عن نفس خزعة الدهون لإجراء فحوصات في المختبر تعكس قدر الإمكان الخصائص في الجسم الحي التي تنظم عملية التمثيل الغذائي لضريبة القيمة المضافة.
على الرغم من أن طرق التفكك غير الأنزيمية القائمة على القوى الميكانيكية لكسر AT تضمن الحد الأدنى من التلاعب ، إلا أنه لا يمكن استخدام هذه الطرق إذا كان الهدف هو دراسة خلايا SVF ، حيث تتمتع بكفاءة أقل في استعادة الخلايا وقابلية بقاء منخفضة للخلايا مقارنة بالطرق الأنزيمية ، وهناك حاجة إلى حجم أكبر من الأنسجة 16,17. الهضم الأنزيمي باستخدام كولاجيناز هو طريقة لطيفة تسمح بالهضم الكافي للكولاجين وبروتينات المصفوفة خارج الخلية للأنسجة الليفية مثل WAT18 وكثيرا ما يستخدم عندما يكون التربسين غير فعال أو ضار19. يوفر البروتوكول إرشادات أساسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة وخلايا SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز ، مما يعطي معلومات لضمان غلة عالية (الكمية والنقاء والسلامة) من إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا الشحمية الناضجة ، بما في ذلك microRNAs ، لتطبيقات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، تم تحسين البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم من خلايا SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لمزيد من التحليل بواسطة قياس التدفقالخلوي 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
تلعب ضريبة القيمة المضافة دورا مهما في تنظيم التمثيل الغذائي والالتهابات. أدى الاهتمام المتزايد بدور الخلايا الشحمية والخلايا المناعية في الالتهاب المزمن المرتبط بالسمنة إلى تطوير تقنيات مختلفة لفصل SVF والخلايا الدهنية الموجودة في AT. ومع ذلك ، فإن معظم التقنيات لا تسمح بالحصول على هاتين…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من المعهد الوطني للطب البيريناتولوجي (أرقام المنح: 3300-11402-01-575-17 و 212250-3210-21002-06-15) و CONACyT ، الصندوق القطاعي للتحقيق في الصحة والأمن الاجتماعي (FOSISS) (رقم المنحة 2015-3-2-61661).
Materials
| 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | – |
| 2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
| 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
| Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | – |
| Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | – |
| APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
| Baker | – | – | 250 ml, non sterile |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
| Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | – |
| Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
| Dissecting forceps | – | – | Steel, serrated jaws and round ends |
| Dissection tray | – | – | Stainless steel |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | – |
| FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | – |
| FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | – |
| FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | – |
| Manual cell counter | – | – | – |
| Mayo dissecting scisors | – | – | Stainless steel |
| Microcentrifuge | – | – | Adjustable temperature |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | – |
| Orbital shaker | – | – | Adjustable temperature and speed |
| P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
| P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
| P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
| P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
| PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | – |
| PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
| PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Pipette controller | – | – | – |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
| Refrigerated centrifuge | – | – | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
| Sterile Specimen container | – | – | – |
| Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
| Tube racks | – | – | For different tube sizes |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | – |
References
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
- Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
- West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
- Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
- Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403 (2017).
- Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
- Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613 (2015).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), 202 (2017).
- Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
- Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88 (2019).
- Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
- Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074 (2018).
- Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), 1-14 (2015).
- van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
- Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457 (2019).
- Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282 (2019).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
- Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321 (2015).
- Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells’ isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54 (2014).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610 (2012).
- Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59 (2011).
- Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
- Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
- Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
- Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
- Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
- Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
- Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693 (2012).
- Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212 (2015).
- van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
- Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
- Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472 (2013).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
- Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D’Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
- Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115 (2017).
- Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807 (2016).
- Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683 (2014).
- Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
- Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
- Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
- Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
- Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514 (2014).
- Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).
