Isolering af levedygtige adipocytter og stromal vaskulær fraktion fra humant visceralt fedtvæv, der er egnet til RNA-analyse og makrofagfænotypning

Summary

Denne protokol tilvejebringer en effektiv kollagenasefordøjelsesmetode til isolering af levedygtige adipocytter og stromale vaskulære fraktion-SVF-celler fra humant visceralt fedt i en enkelt proces, herunder metode til opnåelse af RNA af høj kvalitet fra adipocytter og fænotypificering af SVF-makrofager gennem farvning af flere membranbundne markører til analyse ved flowcytometri.

Abstract

Visceralt fedtvæv (VAT) er et aktivt metabolisk organ, der hovedsageligt består af modne adipocytter og stromale vaskulære fraktionsceller (SVF), som frigiver forskellige bioaktive molekyler, der styrer metaboliske, hormonelle og immunprocesser; I øjeblikket er det uklart, hvordan disse processer reguleres i fedtvævet. Derfor er udviklingen af metoder, der evaluerer hver cellepopulations bidrag til fedtvævets patofysiologi, afgørende. Denne protokol beskriver isolationstrinnene og giver de nødvendige fejlfindingsretningslinjer for effektiv isolering af levedygtige modne adipocytter og SVF fra humane momsbiopsier i en enkelt proces ved hjælp af en enzymatisk nedbrydningsteknik for kollagenase. Desuden er protokollen også optimeret til at identificere makrofagundergrupper og udføre moden adipocyt-RNA-isolering til genekspressionsundersøgelser, hvilket gør det muligt at udføre undersøgelser, der dissekerer interaktionen mellem disse cellepopulationer. Kort fortalt vaskes momsbiopsier, hakkes mekanisk og fordøjes for at generere en enkeltcellesuspension. Efter centrifugering isoleres modne adipocytter ved flotation fra SVF-pelleten. RNA-ekstraktionsprotokollen sikrer et højt udbytte af total RNA (inklusive miRNA’er) fra adipocytter til downstream-ekspressionsassays. Samtidig bruges SVF-celler til at karakterisere makrofagundergrupper (pro- og antiinflammatorisk fænotype) gennem flowcytometrianalyse.

Introduction

Hvidt fedtvæv består ikke kun af fedtceller eller adipocytter, men også af en fedtfri cellefraktion kendt som stromal vaskulær fraktion (SVF), som indeholder en heterogen cellepopulation bestående af makrofager, andre immunceller som regulatoriske T-celler (Tregs) og eosinofiler, preadipocytter og fibroblaster, omgivet af vaskulært væv og bindevæv ^1,2. Fedtvæv (AT) betragtes nu som et organ, der regulerer fysiologiske processer relateret til metabolisme og betændelse gennem adipokiner, cytokiner og mikroRNA’er produceret og frigivet af forskellige celler i vævet med autokrine, parakrin og endokrine virkninger ^3,4. Hos mennesker omfatter hvidt fedtvæv det subkutane fedtvæv (SAT) og det viscerale fedtvæv (VAT) med vigtige anatomiske, molekylære, cellulære og fysiologiske forskelle mellem dem ^2,5. SAT repræsenterer op til 80% af human AT, mens moms er placeret i bukhulen, hovedsageligt i mesenteriet og omentum, der metabolisk er mere aktiv⁶. Desuden er moms et endokrin organ, der udskiller mediatorer med en betydelig indvirkning på kropsvægt, insulinfølsomhed, lipidmetabolisme og inflammation. Derfor fører momsakkumulering til abdominal fedme og fedmerelaterede sygdomme såsom type 2-diabetes, metabolisk syndrom, hypertension og risiko for hjerte-kar-sygdomme, hvilket repræsenterer en bedre forudsigelse for fedmeassocieret dødelighed 6,7,8,9.

Under homeostatiske forhold samarbejder adipocytter, makrofager og de andre immunceller for at opretholde momsmetabolismen gennem udskillelsen af antiinflammatoriske mediatorer¹⁰. Imidlertid fremmer overdreven momsudvidelse rekrutteringen af aktiverede T-celler, NK-celler og makrofager. Faktisk er forholdet mellem makrofagerne i magert moms 5%, mens dette forhold stiger op til 50% i fedme, med makrofagpolarisering fra antiinflammatorisk til proinflammatorisk fænotype, hvilket genererer et kronisk inflammatorisk miljø^10,11.

Som en konsekvens af fedmepandemien er der opstået et forbløffende antal rapporter, der behandler forskellige momsforskningsemner, herunder adipocytbiologi, epigenetik, inflammation, endokrine egenskaber og nye områder som ekstracellulære vesikler, blandt andet 8,10,12,13. Men selvom momsmiljøet er defineret ved krydstale mellem adipocytter og de residente eller ankommende makrofager, har de fleste undersøgelser kun fokuseret på en cellepopulation, og der er knappe oplysninger om interaktionen mellem disse celler i moms og deres patofysiologiske konsekvenser^11,14. Desuden blev værdifulde undersøgelser, der adresserede samspillet mellem adipocyt og makrofag i AT, udført ved hjælp af cellelinjer, der manglede in vivo-primingbetingelserne 11,14,15. En passende strategi til at dissekere disse cellers interaktion eller særlige bidrag i moms kræver isolering af begge celletyper fra den samme fedtbiopsi for at udføre in vitro-assays, der afspejler så ens som muligt de in vivo-egenskaber, der regulerer momsmetabolismen.

Selvom de ikke-enzymatiske dissociationsmetoder baseret på mekaniske kræfter til at bryde AT sikrer minimal manipulation, kan disse metoder ikke bruges, hvis målet er at studere SVF-celler, da de har lavere effektivitet i cellegendannelse og lav cellelevedygtighed sammenlignet med enzymatiske metoder, og der er behov for et større volumen væv^16,17. Enzymatisk fordøjelse ved hjælp af kollagenase er en skånsom metode, der tillader tilstrækkelig fordøjelse af kollagen og ekstracellulære matrixproteiner af fibrøst væv såsom WAT¹⁸ og bruges ofte, når trypsin er ineffektivt eller skadeligt¹⁹. Protokollen giver grundlæggende retningslinjer for fejlfinding for effektiv isolering af levedygtige modne adipocytter og SVF-celler fra humane momsbiopsier i en enkelt proces ved hjælp af en enzymatisk nedbrydningsteknik for kollagenase, der giver information for at sikre høje udbytter (mængde, renhed og integritet) af total RNA fra modne adipocytter, herunder mikroRNA’er, til downstream-ekspressionsapplikationer. Samtidig er protokollen optimeret til at identificere makrofagundergrupper fra SVF-celler gennem farvning af flere membranbundne markører til yderligere analyse ved flowcytometri²⁰.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af IRB ved Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Deltagelse var frivillig, og alle de tilmeldte kvinder underskrev den informerede samtykkeformular. 1. Opsamling af visceralt fedtvæv Få momsbiopsier gennem delvis omenektomi under kejsersnit fra raske voksne kvinder med singletongraviditeter på sigt uden arbejdskraft. Efter livmoderlukning og hæmostase, fortsæt med at identificere større omentum og udvide det på en…

Representative Results

Denne protokol beskriver en enzymatisk metode, der anvender kollagenasefordøjelse efterfulgt af differentiel centrifugering til i en enkelt proces at isolere levedygtige modne adipocytter og SVF-celler fra momsbiopsier opnået fra raske gravide kvinder efter delvis omentektomi. I dette tilfælde bruger vi adipocytterne til RNA-ekstraktion og SVF til makrofagfænotypning. RNA-ekstraktionsprotokollen gjorde det muligt at opnå RNA med en passende renhed, høj integritet og mikroRNA’er fra modne…

Discussion

Moms spiller en afgørende rolle i metabolisk regulering og inflammation. Stigende interesse for adipocytters og immuncellers rolle i kronisk inflammation forbundet med fedme har ført til udvikling af forskellige teknikker til at adskille SVF og fedtceller, der er til stede i AT. Imidlertid tillader de fleste teknikker ikke at opnå disse to forskellige sæt celler, der er levedygtige til downstream-applikationer fra den samme momsbiopsi i en enkelt procedure, hvilket kan være afgørende for undersøgelser vedrørende …

Materials

0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	–
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	–
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	–
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	–	–	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	–
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	–	–	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	–	–	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	–
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	–
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	–
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	–
Manual cell counter	–	–	–
Mayo dissecting scisors	–	–	Stainless steel
Microcentrifuge	–	–	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	–
Orbital shaker	–	–	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	–
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	–	–	–
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	–	–	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	–	–	–
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	–	–	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	–