Summary

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Published: October 20, 2020
doi:

Summary

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Abstract

De vuurstilte Thermobia domestica is een ametabolische, vleugelloze soort die geschikt is voor het bestuderen van de ontwikkelingsmechanismen van insecten die hebben geleid tot hun succesvolle evolutionaire straling op aarde. De toepassing van genetische instrumenten zoals genoombewerking is de sleutel tot het begrijpen van genetische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor evolutionaire transities in een Evo-Devo-benadering. In dit artikel beschrijven we ons huidige protocol voor het genereren en onderhouden van mutante stammen van T. domestica. We rapporteren een droge injectiemethode, als alternatief voor de gerapporteerde natte injectiemethode, waarmee we stabiel hoge overlevingspercentages in geïnjecteerde embryo’s kunnen verkrijgen. We rapporteren ook een geoptimaliseerde omgevingsinstelling om volwassenen te paren en volgende generaties met een hoog rendement te verkrijgen. Onze methode onderstreept het belang om rekening te houden met de unieke biologie van elke soort voor de succesvolle toepassing van genoombewerkingsmethoden op niet-traditionele modelorganismen. We voorspellen dat deze genoombewerkingsprotocollen zullen helpen bij de implementatie van T. domestica als laboratoriummodel en om de ontwikkeling en toepassing van nuttige genetische hulpmiddelen bij deze soort verder te versnellen.

Introduction

Thermobia domestica behoort tot een van de meest basale insectenorden, Zygentoma, die een voorouderlijke ametaboleuze en vleugelloze levenscyclus behoudt. Een dergelijke basale fylogenetische positie en voorouderlijke kenmerken stellen deze soort als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het succes van insecten op aarde, die meer dan 70% van de beschreven diersoorten bestrijken1. T. domestica wordt al lang voornamelijk gebruikt om voorouderlijke kenmerken van insectenfysiologie te bestuderen vanwege de geschikte kenmerken als laboratoriummodel, zoals een relatief korte levenscyclus (2,5-3,0 maanden van embryo tot reproductieve volwassene; Figuur 1A) en een gemakkelijke fokkerij. In de afgelopen drie decennia is het gebruik ervan uitgebreid om voorouderlijke kenmerken van verschillende eigenschappen zoals lichaamsplan, neurale differentiatie en circadiane ritmes2,3,4te onderzoeken.

De toepassing van geavanceerde genetische instrumenten in T. domestica zou dergelijke bijdragen op een breed onderzoeksgebied verder kunnen versnellen. Succesvolle RNA interferentie (RNAi)-gemedieerde gen knockdown in embryo’s, nimfen en volwassenen is gemeld in T. domestica4,5,6. De efficiëntie van systemische RNAi is nog steeds sterk afhankelijk van soorten – het is bijvoorbeeld over het algemeen hoog in coleoptera, terwijl het laag is in de lepidoptera-orde7. De efficiëntie en duur van de RNAi knockdown in T. domestica moet nog worden beoordeeld. Naast RNAi, hebben we eerder gemeld een succesvolle CRISPR / Cas9-gemedieerde gen knock-out in T. domestica8. Het CRISPR/Cas-systeem is op grote schaal toegepast voor genoombewerking bij insecten, met name voor gerichte gen knock-out. Het gebruik ervan kan worden uitgebreid voor andere toepassingen, zoals genverslaggevertest, cellijntracking en manipulatie van transcriptieactiviteit door exogene constructies in te kloppen na de vaststelling van een protocol voor het leveren van componenten van het CRISPR/Cas-systeem inkernen 9. In combinatie met de gepubliceerde genoomassemblage10zou het brede gebruik en de verdere ontwikkeling van de CRISPR/Cas-gebaseerde genoombewerking in T. domestica studies vergemakkelijken die zich richten op de evolutionaire mechanismen achter het uitstekende adaptieve succes van insecten. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor embryomicro-injectie en voor het paren van volwassen T. domestica om een mutante stam te genereren met CRISPR/Cas9. Gezien deze nieuwe methode bespreken we het belang van het overwegen van de unieke biologie van niet-traditionele modelsoorten voor succesvolle toepassingen van deze technieken.

Protocol

1. Onderhoud van laboratoriumkolonies Gebruik voor het onderhoud van wildtype- en mutantpopulaties een grote plastic container (460 mm x 360 mm x 170 mm) met regelmatig kunstmatig visvoer, water in plastic bekers met een ventilatiegat aan de bovenkant, een gevouwen papier om de insecten te verbergen en gelaagd katoen voor het leggen van eieren (figuur 2A). Houd alle T. domestica culturen binnen 37 °C incubators en stel de relatieve luchtvochtigheid (RH) in elke container …

Representative Results

In onze handen kunnen ongeveer 100 eieren goed worden geïnjecteerd met een enkele injectie capillair wanneer het de juiste punt heeft(figuur 3C). Injectie van gRNA/Cas9 ribonucleoproteïne complex in embryo’s binnen de eerste 8 uur na het leggen van eieren resulteert in indels op de gRNA gerichte site. Dit veroorzaakt biallelic mutaties in sommige cellen van de geïnjecteerde generatie (G0) en dus mutant mozaïek fenotypes worden meestal verkregen in G0. Wanneer dit protocol bijvoorbeeld we…

Discussion

Voor de succesvolle generatie van de gewenste T. domestica mutant met CRISPR/Cas9 is het eerst belangrijk om een voldoende aantal geënsceneerde embryo’s te verzamelen voor injectie. Voor een constante verzameling van een voldoende aantal T. domestica-eieren, is de sleutel om een geschikte grootte van de container te selecteren om een lagere populatiedichtheid te hebben, omdat het zou helpen bij het succesvol voltooien van een reeks complex paringsgedrag, dat wordt herhaald na elke vervelling voor volwa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

TO en TD werden ondersteund door respectievelijk JSPS KAKENHI-subsidienummers 19H02970 en 20H02999.

Materials

24-well plate Corning 83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg Integrated DNA Technologies 1081060
Anti-static cleaner Hozan Z-292 for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L AS ONE 4-5606-01 Large container
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000013 Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary Eppendorf 5242957000 Glass injection capillary
High Pack 2440mL AS ONE 5-068-25 Middle-sized container
Incubator Panasonic MIR-554-PJ for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo Toyobo KFX-101 PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand Narishige GJ-8 for holding the micromanipulator
Microloader Eppendorf 5242956003
Micromanipulator Narishige MM-3
Microscope Olympus SZX12 for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA Shimadzu MCE-202 Microchip electrophoresis system
NiceTac Nichiban NW-5 Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair) Pentel ZBS1-0
Plant culture dish SPL Life Sciences 310100 Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris Roche 3115836001
SZX 12 microscope Olympus SZX 12 More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder Maruishi 877113
Tetra Goldfish Gold Growth Spectrum Brands Artificial regular fish food

References

  1. Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
  2. Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
  3. Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
  4. Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
  5. Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
  6. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
  7. Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
  8. Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  9. Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
  10. Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
  11. Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
  12. Nijhout, H. F. . Insect Hormones. , (1994).
  13. Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
  14. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
  15. Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
check_url/kr/61885?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Ohde, T., Minemura, T., Hirose, E., Daimon, T. Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica. J. Vis. Exp. (164), e61885, doi:10.3791/61885 (2020).

View Video