Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica
Summary
Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.
Abstract
Der Feuerbrat Thermobia domestica ist eine ametabolöse, flügellose Art, die sich für die Untersuchung der Entwicklungsmechanismen von Insekten eignet, die zu ihrer erfolgreichen evolutionären Strahlung auf der Erde geführt haben. Die Anwendung genetischer Werkzeuge wie der Genombearbeitung ist der Schlüssel zum Verständnis genetischer Veränderungen, die für evolutionäre Übergänge in einem Evo-Devo-Ansatz verantwortlich sind. In diesem Artikel beschreiben wir unser aktuelles Protokoll zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme von T. domestica. Wir berichten von einer Trockeninjektionsmethode als Alternative zur gemeldeten Nassinjektionsmethode, die es uns ermöglicht, stabil hohe Überlebensraten bei injizierten Embryonen zu erhalten. Wir berichten auch über eine optimierte Umgebungseinstellung, um Erwachsene zu paaren und nachfolgende Generationen mit hoher Effizienz zu erhalten. Unsere Methode unterstreicht, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie jeder Art für die erfolgreiche Anwendung von Genombearbeitungsmethoden auf nicht-traditionelle Modellorganismen zu berücksichtigen. Wir sagen voraus, dass diese Genom-Editing-Protokolle bei der Implementierung von T. domestica als Labormodell helfen und die Entwicklung und Anwendung nützlicher genetischer Werkzeuge in dieser Spezies weiter beschleunigen werden.
Introduction
Thermobia domestica gehört zu einem der basalsten Insektenorden, Zygentoma, das einen uralten ametabolen und flügellosen Lebenszyklus behält. Eine solche basale phylogenetische Position und Ahneneigenschaften setzen diese Art als ein attraktives Modell für die Untersuchung der Mechanismen, die dem Erfolg von Insekten auf der Erde zugrunde liegen, die über 70% der beschriebenen Tierarten abdecken1. T. domestica wird seit langem hauptsächlich zur Untersuchung der Urmerkmale der Insektenphysiologie verwendet, da sie als Labormodell geeignet ist, wie z. B. einen relativ kurzen Lebenszyklus (2,5–3,0 Monate vom Embryo bis zum reproduktiven Erwachsenen; Abbildung 1A) und eine einfache Zucht. In den letzten drei Jahrzehnten wurde seine Verwendung erweitert, um ahnende Eigenschaften verschiedener Merkmale wie Körperplan, neuronale Differenzierung und zirkadiane Rhythmen2,3,4zu untersuchen.
Die Anwendung fortschrittlicher genetischer Werkzeuge in T. domestica könnte solche Beiträge in einem weiten Forschungsgebiet weiter beschleunigen. Erfolgreiche RNA-Interferenz (RNAi)-vermittelter Gen-Knockdown bei Embryonen, Nymphen und Erwachsenen wurde in T. domestica4,5,6berichtet. Die Effizienz von systemischen RNAi ist immer noch stark artenabhängig – zum Beispiel ist sie in coleoptera im Allgemeinen hoch, während sie in der Lepidoptera-Ordnung7niedrig ist. Die Effizienz und Dauer des RNAi-Knockdowns in T. domestica muss noch bewertet werden. Zusätzlich zu RNAi haben wir bereits über einen erfolgreichen CRISPR/Cas9-vermittelten Genknockout in T. domestica8berichtet. Das CRISPR/Cas-System wurde häufig für die Genombearbeitung bei Insekten eingesetzt, insbesondere für gezielte Genknockouts. Seine Verwendung könnte für andere Anwendungen wie Genreporter-Assay, Zelllinienverfolgung und Manipulation der Transkriptionsaktivität erweitert werden, indem exogene Konstrukte nach der Einrichtung eines Protokolls zur Bereitstellung von Komponenten des CRISPR/Cas-Systems in Kerne9eingeschlagen werden. In Kombination mit der veröffentlichten Genombaugruppe10würde die breite Nutzung und Weiterentwicklung der CRISPR/Cas-basierten Genombearbeitung in T. domestica Studien erleichtern, die sich auf die evolutionären Mechanismen hinter dem herausragenden adaptiven Erfolg von Insekten konzentrieren. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Embryo-Mikroinjektion und für die Paarung von Adult T. domestica, um einen mutierten Stamm mit CRISPR/Cas9 zu erzeugen. Unter Berücksichtigung dieser neuartigen Methode diskutieren wir, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie nicht-traditioneller Modellarten für erfolgreiche Anwendungen dieser Techniken zu berücksichtigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die erfolgreiche Erzeugung der gewünschten T. domestica Mutante mit CRISPR/Cas9 ist es zunächst wichtig, eine ausreichende Anzahl von inszenierten Embryonen zur Injektion zu sammeln. Für eine konstante Sammlung einer ausreichenden Anzahl von T. domestica Eiern ist der Schlüssel, eine geeignete Größe des Behälters zu wählen, um eine geringere Bevölkerungsdichte zu haben, da es zum erfolgreichen Abschluss einer Reihe von komplexen Paarungsverhalten beitragen würde, die nach jedem Erwachsene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TO und TD wurden von den JSPS KAKENHI-Zuschussnummern 19H02970 bzw. 20H02999 unterstützt.
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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