फायरब्रेट थर्मोबिया डोमेस्टिका में जीनोम संपादन के लिए अंडा माइक्रोइंजेक्शन और कुशल संभोग
Summary
हम जीनोम संपादन के बाद उत्परिवर्ती उपभेदों को उत्पन्न करने और बनाए रखने के लिए अंडों के पालन, माइक्रोइंजेक्शन और फायरब्रेट थर्मोबिया डोमेस्टिका के कुशल संभोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
फायरब्रेट थर्मोबिया डोमेस्टिका एक अमेबोलस, विंगलेस प्रजातियां हैं जो कीड़ों के विकास तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं, जिसके कारण पृथ्वी पर उनके सफल विकासवादी विकिरण होते हैं। जीनोम संपादन जैसे आनुवंशिक उपकरणों का अनुप्रयोग आनुवंशिक परिवर्तनों को समझने की कुंजी है जो इवो-देवो दृष्टिकोण में विकासवादी संक्रमण के लिए जिम्मेदार हैं। इस लेख में, हम टी डोमेस्टिकाके उत्परिवर्ती उपभेदों को उत्पन्न करने और बनाए रखने के लिए अपने वर्तमान प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एक सूखी इंजेक्शन विधि की रिपोर्ट, रिपोर्ट गीला इंजेक्शन विधि के लिए एक विकल्प के रूप में, कि हमें इंजेक्शन भ्रूण में stably उच्च जीवित रहने की दर प्राप्त करने की अनुमति देता है । हम वयस्कों को दोस्त बनाने और उच्च दक्षता के साथ बाद की पीढ़ियों को प्राप्त करने के लिए एक अनुकूलित पर्यावरण सेटिंग की भी रिपोर्ट करते हैं। हमारी विधि गैर-पारंपरिक मॉडल जीवों के लिए जीनोम संपादन विधियों के सफल अनुप्रयोग के लिए प्रत्येक प्रजाति के अद्वितीय जीव विज्ञान को ध्यान में रखने के महत्व को रेखांकित करती है। हम भविष्यवाणी करते हैं कि ये जीनोम संपादन प्रोटोकॉल टी डोमेस्टिका को प्रयोगशाला मॉडल के रूप में लागू करने और इस प्रजाति में उपयोगी आनुवंशिक उपकरणों के विकास और अनुप्रयोग में और तेजी लाने में मदद करेंगे।
Introduction
थर्मोबिया डोमेस्टिका सबसे बेसल कीट आदेशों में से एक है, ज़ाइजेंटोमा, जो एक पैतृक अमेतबोलस और पंखरहित जीवन चक्र को बरकरार रखता है। इस तरह के बेसल फिलोजेनेटिक स्थिति और पैतृक विशेषताओं ने इस प्रजाति को पृथ्वी पर कीड़ों की सफलता में अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल के रूप में सेट किया, जो वर्णित पशु प्रजातियों के 70% से अधिक कवरकरते हैं 1। टी डोमेस्टिका का उपयोग मुख्य रूप से प्रयोगशाला मॉडल के रूप में अपनी उपयुक्त विशेषताओं के कारण कीट शरीर विज्ञान की पैतृक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जैसे अपेक्षाकृत कम जीवनचक्र (भ्रूण से प्रजनन वयस्क तक 2.5-3.0 महीने; चित्रा 1A) और एक आसान प्रजनन। पिछले तीन दशकों में, शरीर की योजना, तंत्रिका भेदभाव, और सर्कैडियन लय2,3,4 जैसे विभिन्न लक्षणों की पैतृक विशेषताओं की जांच करने के लिएइसकेउपयोग का विस्तार किया गया है।
टी डोमेस्टिका में उन्नत आनुवंशिक उपकरणों के आवेदन और एक व्यापक अनुसंधान क्षेत्र में इस तरह के योगदान में तेजी लाने सकता है । सफल आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) -मध्यस्थता जीन भ्रूण, नस्लों में नॉकडाउन, और वयस्कों टी डोमेस्टिका4,5, 6में सूचित किया गया है। प्रणालीगत आरएनएआई की दक्षता अभी भी अत्यधिक प्रजातियों पर निर्भर है – उदाहरण के लिए, यह आम तौर पर कोलोप्टेरा में उच्च होता है जबकि यह लेपिडोप्टेरा क्रम 7 में कमहोताहै। टी डोमेस्टिका में आरएनएआई नॉकडाउन की दक्षता और अवधि का आकलन अभी किया जाना है । आरएनएआई के अलावा, हमने पहले टी डोमेस्टिका8में एक सफल CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन नॉकआउट की सूचना दी है । CRISPR/Cas प्रणाली व्यापक रूप से विशेष रूप से लक्षित जीन नॉकआउट के लिए कीड़ों में जीनोम संपादन के लिए लागू किया गया है । इसके उपयोग को अन्य अनुप्रयोगों जैसे जीन रिपोर्टर परख, सेल वंश ट्रैकिंग, और न्यूक्लिय9में CRISPR/कैस प्रणाली के घटकों को वितरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना के बाद एक्सोजेनस निर्माण में दस्तक देकर प्रतिलेखन गतिविधि में हेरफेर के लिए विस्तारित किया जा सकता है । प्रकाशित जीनोम असेंबली10के साथ संयुक्त, टी डोमेस्टिका में CRISPR/Cas-आधारित जीनोम संपादन के व्यापक उपयोग और आगे के विकास से कीड़ों की उत्कृष्ट अनुकूली सफलता के पीछे विकासवादी तंत्र पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों को सुविधाजनक बनाया जा सकेगा । यहां, हम भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और वयस्क टी डोमेस्टिका को संभोग करने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करके एक उत्परिवर्ती तनाव उत्पन्न करते हैं । इस उपन्यास विधि को ध्यान में रखते हुए, हम इन तकनीकों के सफल अनुप्रयोगों के लिए गैर-पारंपरिक मॉडल प्रजातियों के अद्वितीय जीव विज्ञान पर विचार करने के महत्व पर चर्चा करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 के साथ वांछित टी डोमेस्टिका उत्परिवर्ती की सफल पीढ़ी के लिए, इंजेक्शन के लिए पर्याप्त संख्या में मंचन भ्रूण एकत्र करना पहली बार महत्वपूर्ण है । टी डोमेस्टिका अंडे की पर्याप्त संख्या के निर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
टीओ और टीडी को क्रमशः जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबर 19H02970 और 20H02999 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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