Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat
Summary
Forniamo un protocollo dettagliato per l’allevamento, la microiniezione delle uova e per l’accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l’editing del genoma.
Abstract
Il firebrat Thermobia domestica è una specie ametabolica e senza ali adatta allo studio dei meccanismi di sviluppo degli insetti che hanno portato alla loro riuscita radiazione evolutiva sulla terra. L’applicazione di strumenti genetici come l’editing del genoma è la chiave per comprendere i cambiamenti genetici che sono responsabili delle transizioni evolutive in un approccio Evo-Devo. In questo articolo, descriviamo il nostro attuale protocollo per la generazione e la manutenzione di ceppi mutanti di T. domestica. Riportiamo un metodo di iniezione secca, in alternativa al metodo di iniezione umida riportato, che ci consente di ottenere tassi di sopravvivenza stabilmente elevati negli embrioni iniettati. Reportiamo anche un ambiente ottimizzato per accoppiare gli adulti e ottenere le generazioni successive con alta efficienza. Il nostro metodo sottolinea l’importanza di tenere conto della biologia unica di ciascuna specie per il successo dell’applicazione dei metodi di modifica del genoma agli organismi modello non tradizionali. Prevediamo che questi protocolli di editing del genoma aiuteranno nell’implementazione di T. domestica come modello di laboratorio e accelereranno ulteriormente lo sviluppo e l’applicazione di strumenti genetici utili in questa specie.
Introduction
Thermobia domestica appartiene a uno degli ordini di insetti più basali, Zygentoma, che conserva un ciclo di vita ancestrale ametabolico e senza ali. Tale posizione filogenetica basale e caratteristiche ancestrali hanno fissato questa specie come un modello attraente per studiare i meccanismi alla base del successo degli insetti sulla Terra, che coprono oltre il 70% della specie animaledescritta 1. T. domestica è stato a lungo utilizzato principalmente per studiare le caratteristiche ancestrali della fisiologia degli insetti a causa delle sue caratteristiche adatte come modello di laboratorio, come un ciclo di vita relativamente breve (2,5-3,0 mesi dall’embrione all’adulto riproduttivo; Figura 1A) e un allevamento facile. Negli ultimi tre decenni, il suo uso è stato ampliato per indagare le caratteristiche ancestrali di vari tratti come la pianta corporea, la differenziazione neurale e i ritmicircadiani 2,3,4.
L’applicazione di strumenti genetici avanzati in T. domestica potrebbe accelerare ulteriormente tali contributi in un’ampia area di ricerca. Il successo dell’interferenza dell’RNA (RNAi) mediato dal gene in embrioni, ninfe e adulti è stato riportato in T. domestica4,5,6. L’efficienza della RNAi sistemica è ancora altamente dipendente dalle specie, ad esempio è generalmente elevata nei coleotteri mentre è bassa nell’ordine dei lepidotteri7. L’efficienza e la durata del knockdown RNAi in T. domestica devono ancora essere valutate. Oltre a RNAi, abbiamo precedentemente segnalato un knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 di successo in T. domestica8. Il sistema CRISPR/Cas è stato ampiamente applicato per l’editing del genoma negli insetti, in particolare per il knockout genico mirato. Il suo uso potrebbe essere ampliato per altre applicazioni come il test gene reporter, il tracciamento del lignaggio cellulare e la manipolazione dell’attività trascrizionale bussando a costrutti esogeni dopo l’istituzione di un protocollo per la consegna di componenti del sistema CRISPR / Cas nei nuclei9. In combinazione con l’assemblaggio del genomapubblicato 10, l’ampio utilizzo e l’ulteriore sviluppo dell’editing del genoma basato su CRISPR /Cas in T. domestica faciliterebbero gli studi incentrati sui meccanismi evolutivi alla base dell’eccezionale successo adattivo degli insetti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la microiniezione embrionale e per l’accoppiamento di T. domestica adulto per generare un ceppo mutante utilizzando CRISPR / Cas9. Considerando questo nuovo metodo, discutiamo l’importanza di considerare la biologia unica delle specie modello non tradizionali per applicazioni di successo di queste tecniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per la generazione di successo del mutante T. domestica desiderato con CRISPR / Cas9, è prima importante raccogliere un numero sufficiente di embrioni messi in scena per l’iniezione. Per una raccolta costante di un numero sufficiente di uova T. domestica, la chiave è selezionare una dimensione appropriata del contenitore per avere una densità di popolazione inferiore perché aiuterebbe il completamento di una serie di complessi comportamenti di accoppiamento, che viene ripetuto dopo ogni muta adulta<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TO e TD sono stati supportati rispettivamente dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999.
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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