파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

요약

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

파이어 브라트 Thermobia 국내는 지구상에서 성공적인 진화 방사선을 주도 곤충의 발달 메커니즘을 연구에 적합한 병형, 날개없는 종입니다. 게놈 편집과 같은 유전 공구의 응용은 Evo-Devo 접근에 있는 진화적인 전환에 책임 있는 유전 변경을 이해하는 열쇠입니다. 이 문서에서는 T. 국산균의 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위한 현재 프로토콜을 설명합니다. 우리는 우리가 주입된 태아에서 안정적으로 높은 생존율을 얻을 수 있도록 보고된 습식 주입 방법에 대한 대안으로, 건식 주입 방법을 보고합니다. 또한 성인을 짝짓기하고 고효율로 후속 세대를 얻기 위해 최적화된 환경 설정을 보고합니다. 우리의 방법은 비 전통적인 모형 유기체에 게놈 편집 방법의 성공적인 적용을 고려하여 각 종의 독특한 생물학을 취하는 의 중요성을 강조합니다. 우리는 이러한 게놈 편집 프로토콜이 실험실 모델로 T. 국내를 구현하고이 종에서 유용한 유전 도구의 개발 및 적용을 더욱 가속화하는 데 도움이 될 것으로 예측합니다.

서론

Thermobia 국내는 가장 기저 곤충 주문 중 하나에 속한다, Zygentoma, 이는 조상 과 날개없는 수명 주기를 유지. 이러한 기저 계통유전학적 위치와 조상특성은 이 종을 지구상의 곤충의 성공기막이되는 메커니즘을 연구하기 위한 매력적인 모델로 설정하여 기술된 동물종^1의70% 이상을 커버한다. T. 국내는 상대적으로 짧은 수명 주기 (태아에서 생식 성인에 2.5-3.0 개월)와 같은 실험실 모델로적합한 기능 때문에 곤충 생리학의 조상 특성을 연구하기 위해 주로 사용되어 왔습니다. 그림 1A) 그리고 쉽게 번식. 지난 3년 동안 신체 계획, 신경 분화 및 circadian 리듬^2,3,4와같은 다양한 특성의 조상 특성을 조사하기 위해 그 사용이 확장되었습니다.

T. 국내에서 고급 유전 도구의 응용 프로그램은 더 넓은 연구 분야에서 이러한 기여를 가속화 할 수 있습니다. 성공적인 RNA 간섭(RNAi)-매개 유전자 녹다운 배아, 님프....

프로토콜

1. 실험실 식민지의 유지 보수

1. 야생형 및 돌연변이 집단의 유지를 위해 일반 인공 어류 식품이 있는 대형 플라스틱 용기(460mm x 360mm x 170mm)를 사용하고, 상단에 환기 구멍이 있는 플라스틱 컵의 물, 곤충을 숨기기 위한 접힌 종이, 계란을 낳을 수 있는 겹겹이 있는면(그림 2A)을사용한다. 모든 T. 국산 배양을 37°C 인큐베이터 내부에 보관하고 각 용기 내부에 상대 습도(RH)를 60%-80%로 설정합니다.
   참고: T. 국산은 ^{대기(11)로부터}수증기를 흡수하기 때문에 직접 수분 공급이 필요하지 않습니다. 적절한 RH는 상단에 환기 구멍을 포함하는 플라스틱 컵에서 수증기의 존재 또는 각 용기 내부의 뚜껑이없는 컵에서 유지된다. 문화가 포함된 전체 인큐베이터 내부에 가습기를 가습할 필요가 없습니다. 이 프로토콜에 기재된 조건하에서 각 발달 단계의 대략적인 지속 시간은 도 1에도시된다. 개발 속도는 온도 및/또는 RH^12를변경하여 조정할 수 있습니다.
2. 주기적으로 음식을 추가합니다. 물이 마르기 전에 물을 넣습니다.....

결과

우리 손에는, 약 100개의 계란이 적당한 팁(도 3C)이있을 때 단 하나 주입 모세관으로 잘 주입될 수 있습니다. gRNA/Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체를 주사하여 계란 을 낳은 후 첫 8시간 내에 배아에 있는 gRNA 표적 부위에 인델이 생성된다. 이것은 주입된 생성 (G0)의 몇몇 세포에 있는 쌍경변 돌연변이를 일으키는 원인이 되고 이렇게 돌연변이 모자이크 표현형은 일반적으로 G0에서 수득됩니다. 예를 들어, 이 프로토콜이 백색 유전자를 표적으로 하도록 설계된 gRNA를 주입하는 데 사용되었을 때, G0 님프의 32.6%는 그들의 복합 눈과 등쪽 부위에서 색소침착의 부분적 손실을 나타낸다(그림5)^8.

현재 설명된 건식 주입 방법을 사용하여, 80-120개의 계란이 주입된 배아의 생존율이 40%-60%만큼 높.......

토론

CRISPR/Cas9를 사용하여 원하는 T. 국산 돌연변이의 성공적인 생성을 위해, 주사를 위해 충분한 수의 단계적 배아를 수집하는 것이 우선이다. T. 국산 계란의 충분한 수의 일정한 컬렉션의 경우, 핵심은 모든 성인 몰트⁽¹³⁾후에 반복되는 일련의 복잡한 짝짓기 동작의 성공적인 완료에 도움이 될 것이기 때문에 낮은 인구 밀도를 가지도록 용기의 적절한 크기를 선택하는 것입니다. 남성 T. 국선 성인은 정자를 통해 여성에게 간접적으로 정자를 전달합니다. 스위트맨(1938)은 짝짓기 행동의 개시에서 20~35분 정도 걸리는 남성 성인이^{정자(12)의}배치에 걸린다고 보고했다. 다른 개인에 의해 짝짓기 쌍 사이의 상호 작용의 교란은 조밀 한 환경에서 더 자주 발생할 수있는 성공적인 수정을 방지 할 가능성이 높습니다.

계란은 우리의 프로토콜에 충분한 계란을.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 플레이트	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µ g	Integrated DNA Technologies	1081060
정전기 방지 세정제	Hozan	Z-292	24웰 플레이트에서 정전기 제거용
배리어 박스 20.7L	AS ONE	4-5606-01	대형 용기
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	전자식 마이크로인젝터
Femtotip II, 주입 모세관	Eppendorf	5242957000	유리 주입 모세관
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	중형 용기
인큐베이터	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 ° C 배양. 인큐베이터 내부를 가습할 필요가 없습니다.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR 효소. 조잡한 템플릿의 증폭에 최적화되었습니다.
마이크로 로더	에펜도르프	5242956003
마이크로 매니퓰레이터	Narishige	MM-3
			. 35X 이상의 배율은 마이크로 주입에 충분합니다.
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	마이크로칩 전기영동 시스템
NiceTac	Nichiban	NW-5	유리 슬라이드에 계란을 놓는 양면 테이프
페인트 브러시(말 털)	Pentel	ZBS1-0
식물 배양 접시	SPL Life Sciences	310100	대형 및 중형 용기에 대한 짝짓기 접시 및 물 공급
Proteinase K, 재조합, Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 현미경	림푸스	SZX 12	35X 이상의 배율은 미세 주입에 충분합니다
활석 가루	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold	Growth Spectrum Brands		인공 일반 생선 식품

유전형 분석을 위한 마이크로 매니퓰레이터 현미경 Olympus SZX12를 고정하기위한 마그네틱 스탠드 Narishige GJ-8의 PCR 등급 Lyophilizate 올