حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis
Summary
هنا، ونحن نصف أساليب لحقن الجرو والكبار كفاءة في Nasonia vitripennis كبدائل يمكن الوصول إليها للتحنيم الدقيق الجنين، وتمكين التحليل الوظيفي للجينات ذات الأهمية باستخدام إما الحمض النووي الريبي إسكات عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi) أو خروج المغلوب الجينات عن طريق CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم.
Abstract
دبور جوهرة، Nasonia vitripennis،أصبح نظام نموذج فعال لدراسة علم الوراثة اللاجينية لتحديد الجنس haplo-diploid، بيولوجيا كروموسوم B، التفاعلات المضيفة- symbiont، speciation، وتوليف السم. على الرغم من توافر العديد من الأدوات الجزيئية، بما في ذلك CRISPR/Cas9، لا تزال الدراسات الوراثية الوظيفية محدودة في هذا الكائن الحي. وينبع القيد الرئيسي لتطبيق تكنولوجيا CRISPR/Cas9 في N. vitripennis من تحديات الميكروبيكشن الجنيني. حقن الأجنة صعبة بشكل خاص في هذا الكائن الحي وبشكل عام في العديد من الدبابير الطفيليات ، بسبب صغر حجم الجنين ومتطلبات جروة مضيفة للتطور الجنيني. ولمعالجة هذه التحديات، تم تحسين الولادة المعقدة للريبونوكليوبروتين Cas9 إلى المبيضين الإناث عن طريق حقن البالغين، بدلا من الحقن المجهري الجنيني، مما أدى إلى تعديلات جرثومية جسدية وقابلة للتكرار. تم تحسين إجراءات الحقن في الخوادر والدبابير الأنثوية باستخدام إما التحكم في ReMOT (تحويل المبيض بوساطة المستقبلات للشحن) أو BAPC (كبسولات الببتيد الأمفيفيلية المتفرعة). وتبين أن هذه الأساليب بدائل فعالة لحقن الأجنة، مما يتيح حدوث طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للتكسيت.
Introduction
CRISPR/Cas9 تحرير الجينات هي تقنية قوية للدراسات الوراثية الوظيفية، وخاصة في العديد من الكائنات الحية نموذج ارتفاع مثل دبور جوهرة، Nasonia vitripennis. سهولة تربية وتوافر الجينوم الكامل يجعل دبور جوهرة نظام تجريبي مهم لتوضيح الآليات الجزيئية للعمليات البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال، N. vitripennis وقد استخدمت مؤخرا لكشف الأساس اللاجيني لنظام تحديد الجنس haplodiploid1،2، وبيولوجيا الكروموسومات B3،4،5،6، والأساس الوراثي للتنظيم circadian والموسمية7،8. بعض الميزات التي تجعل N. vitripennis قابلة للعمل مع تشمل وقت الجيل القصير (~ 2 أسابيع عند 25 درجة مئوية)، وارتفاع معدلات الإنجاب، وسهولة فصل الجنس في مرحلة pupal، والقدرة على diapause وتخزين سلالات في 4 درجة مئوية. تبدأ دورة الحياة مع الدبابير الإناث تطفل الخوادر من الذبابة ، بولاتا التابوت. من خلال ovipositor بهم ، تضع الإناث ما يصل إلى 50 بيضة في حالة الجراء من الذبابة. البيض تتطور إلى اليرقات التي تتغذى على الجراء S. بولاتا، تستمر في التطور على مدى الأيام القليلة المقبلة، ومن ثم pupate، تليها eclosion الكبار والظهور من puparium المضيف9.
الأدوات الجزيئية لإجراء الدراسات الجينية الوظيفية في N. vitripennis, مثل تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi)10 و CRISPR/Cas911,12, متوفرة, ولكنها محدودة, ويرجع ذلك في المقام الأول إلى صعوبات في إجراء الميكروبيكشنات الجنينية13. كما N. vitripennis البيض تتطلب مضيف الجرو للتنمية، والتلاعب البيض هو صعب للغاية. يجب جمع الأجنة مرحلة ما قبل blastoderm من الخوادر blowfly المضيف، وميكرونجيكت بسرعة، ونقلها على الفور مرة أخرى إلى المضيف للتنمية13. تتطلب هذه الخطوات الدقة والتدريب المتخصص لتجنب إتلاف الأجنة المجهرية أو يستضيف الجرو13. وعلاوة على ذلك ، فإن البيض صغير جدا وهش ، خاصة بعد الاحتراط الدقيق ، مع السيتوبلازم اللزج جدا مما يسبب انسداد مستمر لإبرة الحقن13. هذه الميزات تجعل الاختبارات الدقيقة الجنينية صعبة بشكل استثنائي ، مما يتطلب مشغلين مدربين تدريبا عاليا ومعدات متخصصة غائبة في معظم مختبرات N. vitripennis.
ومن شأن تحسين أساليب الحقن البديلة لتوصيل الكواشف CRISPR أن يسهم في توطيد N. vitripennis ككائن حي نموذجي. التلاعب من الخوخ والبالغين هو أقل تحديا من التلاعب الأجنة ويمكن تحقيقه مع الإعداد حقن الأساسية. هنا، يتم وصف بروتوكولين لحقن الخوادر والبالغين: واحد ينطوي على معدات متخصصة للحقن، والآخر ينطوي على استخدام تجميع أنبوب التنفس مزودة إبرة شعرية زجاجية. استخدام أنبوب التنفس مناسب بشكل خاص للمختبرات التي لا يمكنها الوصول إلى المعدات المتخصصة للأنابيب الدقيقة للجنين. يتم إظهار الحقن الفعالة لمراحل النمو المختلفة من N. vitripennis، بما في ذلك الخوخ الأبيض أو الأسود والدبابير البالغة. الدبابير في مرحلة الجرو الأبيض مناسبة بشكل خاص لتجارب الضربة القاضية بوساطة RNAi. على الرغم من أن RNAi في ناسونيا وصفت لأول مرة من قبل لينش وديسبلان في 200610, لا يوجد إجراء بصري متاح لكيفية إجراء حقن RNAi. وقد استخدمت مؤخرا RNAi لاكتشاف الجين haploidizer من B-كروموسوم PSR(نسبة الجنس الأبوي) 3 ودراسة مشاركة الجين على مدار الساعة, الفترة, في N. vitripennis الإيقاعات البيولوجية7.
يمكن استخدام الخوادر السوداء والدبابير البالغة للحث على تحرير الجينات الجرثومية CRISPR/Cas9 باستخدام ReMOT Control (تحويل المبيض بوساطة المستقبلات للشحن) وبروتوكولات BAPC (كبسولات الببتيد الأمفيفيلية المتفرعة). وقد وصفت هذه الطرق تسليم المبيض اثنين مؤخرا لتكون فعالة في ناسونيا لتوليد الطفرات الجرثومية في الجين المستهدف, cinnabar7,12. هنا ، يتم توفير بروتوكول مبسط للحقن بما في ذلك إجراء بصري لمنهجية خطوة بخطوة لكل من الحقن الجروية وحقن البالغين التي يمكن استخدامها لتوليد دراسات علم الوراثة الوظيفية في Nasonia وعلى الأرجح في الدبابير الطفيليات الأخرى ، دون الحاجة إلى معدات متخصصة وتجاوز التجميل الجنيني الدقيق.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع الاستخدام المتزايد مؤخرا من nasonia vitripennis ككائن حي نموذجي لمختلف الأسئلة البيولوجية2،3،7،17، هناك حاجة لتطوير وتحسين أساليب الحقن لتمكين بروتوكول مبسط وفعال للتحليل الوظيفي لجينات N. vitripennis. الأساليب الحالية ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء UCSD الموجهة إلى O.S.A. ومنحة NSF/BIO 1645331 إلى J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
