Pupal- og voksenindsprøjtninger til RNAi- og CRISPR-genredigering i Nasonia vitripennis
Summary
Her beskriver vi metoder til effektive pupal- og voksenindsprøjtninger i Nasonia vitripennis som tilgængelige alternativer til embryomikroinjektion, der muliggør funktionel analyse af gener af interesse ved hjælp af enten RNA-lyddæmpning via RNA-interferens (RNAi) eller gen knockout via CRISPR / Cas9 genomredigering.
Abstract
Juvelhvepsen, Nasonia vitripennis, er blevet et effektivt modelsystem til at studere epigenetik af haplo-diploid sexbestemmelse, B-kromosombiologi, værtssymiontinteraktioner, speciation og giftsyntese. På trods af tilgængeligheden af flere molekylære værktøjer, herunder CRISPR/Cas9, er funktionelle genetiske undersøgelser stadig begrænsede i denne organisme. Den største begrænsning ved at anvende CRISPR/Cas9-teknologi i N. vitripennis skyldes udfordringerne ved embryonale mikroinjektioner. Injektioner af embryoner er særligt vanskelige i denne organisme og generelt i mange parasitoide hveps på grund af lille embryostørrelse og kravet om en værtspuppe til embryonal udvikling. For at løse disse udfordringer blev Cas9 ribonucleoprotein kompleks levering til kvindelige æggestokke ved voksen injektion snarere end embryonal mikroinjection optimeret, hvilket resulterede i både somatiske og arvelige kønsceller. Injektionsprocedurerne blev optimeret i pupper og kvindelige hveps ved hjælp af enten ReMOT Control (Receptor-Medieret æggetransduktion af last) eller BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Disse metoder har vist sig at være effektive alternativer til embryon injektion, så sted-specifikke og arvelige kønsceller mutationer.
Introduction
CRISPR/Cas9 genredigering er en kraftfuld teknologi til funktionelle genetiske undersøgelser, især i mange stigende modelorganismer som juvel wasp, Nasonia vitripennis. Den lette opdræt og tilgængeligheden af et komplet genom gør juvel hvepsen til et vigtigt eksperimentelt system til belysning af de molekylære mekanismer i forskellige biologiske processer. For eksempel er N. vitripennis for nylig blevet brugt til at optrævle det epigenetiske grundlag for haplodiploid sexbestemmelsessystemet1,2, biologien i B-kromosomer3,4,5,6og det genetiske grundlag for døgnrytmen og sæsonregulering7,8. Nogle af de funktioner, der gør N. vitripennis modtagelig for arbejde med, omfatter kort generationstid (~2 uger ved 25 °C), høje reproduktionshastigheder, let kønsadskillelse på pupalstadiet og evnen til at diapause og gemme stammer ved 4 °C. Livscyklussen begynder med kvindelige hveps, der parasiterer blæserens pupper, Sarcophaga bullata. Gennem deres ovipositor lå kvinder op til 50 æg i puppekassen af blowfly. Æg udvikler sig til larver, der fodrer på S. bullata pupa, fortsætter med at udvikle sig i løbet af de næste par dage og derefter popper, efterfulgt af voksen eclosion og fremkomst fra værts puparium9.
Molekylære værktøjer til at udføre funktionelle genetiske undersøgelser i N. vitripennis, såsom RNA-interferens (RNAi)10 og CRISPR/Cas911,12, er tilgængelige, men er begrænsede, primært på grund af vanskeligheder med at udføre embryonale mikroinjections13. Som N. vitripennis æg kræver en pupal vært for udvikling, æg manipulation er meget udfordrende. Præ-blastoderm fase embryoner skal indsamles fra værten blowfly pupper, hurtigt microinjected, og straks overføres tilbage til værten for udvikling13. Disse trin kræver præcision og specialiseret træning for at undgå at beskadige de mikroindsprøjtede embryoner eller pupalværterne13. Desuden er æggene meget små og skrøbelige, især efter mikroinjections, med et meget tyktflydende cytoplasma, der forårsager en kontinuerlig tilstopning af injektionsnålen13. Disse funktioner gør embryonale mikroinjections usædvanligt udfordrende, der kræver højtuddannede operatører og specialiseret udstyr, der er fraværende i de fleste N. vitripennis laboratorier.
Optimering af alternative injektionsmetoder til levering af CRISPR-reagenser vil bidrage til konsolideringen af N. vitripennis som modelorganisme. Manipulation af pupper og voksne er mindre udfordrende end at manipulere embryoner og kan opnås med en grundlæggende injektion setup. Her beskrives to protokoller for injektion af pupper og voksne: den ene involverer specialiseret udstyr til injektioner, og den anden involverer brug af en aspiratorrørssamling udstyret med en glaskapillær nål. Brugen af et aspiratorrør er særligt velegnet til laboratorier, der ikke har adgang til specialiseret udstyr til embryomikroinjections. Effektive injektioner af forskellige udviklingsstadier af N. vitripennis, herunder hvide eller sorte pupper og voksne hveps, påvises. Hvepse på den hvide pupal fase er særligt velegnede til RNAi-medieret knockdown eksperimenter. Selvom RNAi i Nasonia først blev beskrevet af Lynch og Desplan i 200610, er der ingen visuel procedure tilgængelig for, hvordan RNAi-injektioner udføres. RNAi blev for nylig brugt til at opdage haploidizer genet af B-kromosom PSR (Paternal Sex Ratio)3 og til at studere inddragelsen af uret genet, periode, i N. vitripennis biologiske rytmer7.
Sort pupper og voksne hveps kan bruges til at fremkalde CRISPR/Cas9-genredigering ved hjælp af ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) og BAPC -protokoller (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Disse to æggestokke leveringsmetoder er for nylig blevet beskrevet som effektive i Nasonia til at generere kønsceller mutationer i målgenet, cinnabar7,12. Her er der fastsat en forenklet protokol for injektioner, herunder en visuel procedure for en trinvis metode til både pupal- og vokseninjektioner, der kan bruges til at generere funktionelle genetikundersøgelser i Nasonia og sandsynligvis i andre parasitoide hveps, uden at kræve specialiseret udstyr og omgå embryonale mikroinjektioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den nylige øgede brug af Nasonia vitripennis som modelorganisme til forskellige biologiske spørgsmål2,3,7,17, er der behov for at udvikle og optimere injektionsmetoder for at muliggøre en forenklet og effektiv protokol til funktionel analyse af N. vitripennis gener. De nuværende metoder, der involverer embryonal mikroinjection af genredigering reagenser er udfordrende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af UCSD-startmidler rettet mod O.S.A. og NSF/BIO-tilskud 1645331 til J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
