Injections de nymphes et d’adultes pour l’arNi et l’édition de gènes CRISPR chez Nasonia vitripennis
Summary
Ici, nous décrivons les méthodes d’injections pupales et adultes efficaces dans Nasonia vitripennis comme des alternatives accessibles à la microinjection embryonnaire, permettant l’analyse fonctionnelle des gènes d’intérêt en utilisant soit le silence de l’ARN via l’interférence ARN (ARNi), soit l’élimination du gène via l’édition du génome CRISPR / Cas9.
Abstract
La guêpe bijou, Nasonia vitripennis, est devenue un système modèle efficace pour étudier l’épigénétique de la détermination du sexe haplo-diploïde, de la biologie du chromosome B, des interactions hôte-symbiote, de la spéciation et de la synthèse du venin. Malgré la disponibilité de plusieurs outils moléculaires, dont CRISPR/Cas9, les études génétiques fonctionnelles sont encore limitées dans cet organisme. La principale limite de l’application de la technologie CRISPR/Cas9 à N. vitripennis provient des défis des microinjections embryonnaires. Les injections d’embryons sont particulièrement difficiles dans cet organisme et en général chez de nombreuses guêpes parasitoïdes, en raison de la petite taille de l’embryon et de la nécessité d’une chrysalide hôte pour le développement embryonnaire. Pour relever ces défis, l’administration complexe de ribonucléoprotéine Cas9 dans les ovaires femelles par injection adulte, plutôt que la microinjection embryonnaire, a été optimisée, ayant pour résultat des modifications somatiques et héritables de germline. Les procédures d’injection ont été optimisées dans les pupes et les guêpes femelles en utilisant soit reMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) ou BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Ces méthodes se sont avérées être des alternatives efficaces à l’injection d’embryon, permettant des mutations germinales spécifiques au site et héréditaires.
Introduction
L’édition du gène CRISPR/Cas9 est une technologie puissante pour les études génétiques fonctionnelles, en particulier dans de nombreux organismes modèles émergents tels que la guêpe bijou, Nasonia vitripennis. La facilité d’élevage et la disponibilité d’un génome complet font de la guêpe jewel un système expérimental important pour élucider les mécanismes moléculaires de différents processus biologiques. Par exemple, N. vitripennis a récemment été utilisé pour démêler la base épigénétique du système haplodiploïde de détermination du sexe1,2,la biologie des chromosomes B3,4,5,6et la base génétique de la régulation circadienne et saisonnière7,8. Certaines des caractéristiques qui rendent N. vitripennis facile à travailler incluent un temps de génération court (~ 2 semaines à 25 ° C), des taux de reproduction élevés, une séparation facile du sexe au stade nymphal et la capacité de diapause et de stocker des souches à 4 ° C. Le cycle de vie commence avec des guêpes femelles parasitant les pupes de la mouche à mouches, Sarcophaga bullata. Grâce à leur ovipositeur, les femelles pondent jusqu’à 50 œufs dans le cas nymphal de la mouche. Les œufs se développent en larves qui se nourrissent de la chrysalide de S. bullata, continuent de se développer au cours des prochains jours, puis se nymphosent, suivies de l’éclosion adulte et de l’émergence de l’hôte puparium9.
Des outils moléculaires permettant d’effectuer des études génétiques fonctionnelles chez N. vitripennis,tels que l’interférence ARN (ARNi)10 et CRISPR/Cas911,12,sont disponibles, mais sont limités, principalement en raison de difficultés à réaliser des microinjections embryonnaires13. Comme les œufs de N. vitripennis ont besoin d’un hôte nymphal pour leur développement, la manipulation des œufs est très difficile. Les embryons au stade pré-blastoderme doivent être prélevés sur les pupes de mouches à mouches hôtes, rapidement microinjectés et immédiatement transférés à l’hôte pour le développement13. Ces étapes nécessitent une précision et une formation spécialisée pour éviter d’endommager les embryons micro-injectés ou les hôtes nymphaux13. De plus, les œufs sont très petits et fragiles, surtout après microinjections, avec un cytoplasme très visqueux provoquant un colmatage continu de l’aiguille d’injection13. Ces caractéristiques rendent les microinjections embryonnaires exceptionnellement difficiles, nécessitant des opérateurs hautement qualifiés et un équipement spécialisé qui est absent dans la plupart des laboratoires de N. vitripennis.
L’optimisation des méthodes d’injection alternatives pour l’administration de réactifs CRISPR contribuerait à la consolidation de N. vitripennis en tant qu’organisme modèle. La manipulation des pupes et des adultes est moins difficile que la manipulation d’embryons et peut être accomplie avec une configuration d’injection de base. Ici, deux protocoles sont décrits pour l’injection de pupes et d’adultes : l’un impliquant un équipement spécialisé pour les injections, et l’autre impliquant l’utilisation d’un ensemble tube aspirateur équipé d’une aiguille capillaire en verre. L’utilisation d’un tube aspirateur est particulièrement adaptée aux laboratoires qui n’ont pas accès à des équipements spécialisés pour les microinjections embryonnaires. Des injections efficaces de différents stades de développement de N. vitripennis,y compris des pupes blanches ou noires et des guêpes adultes, sont démontrées. Les guêpes au stade nymphal blanc sont particulièrement adaptées aux expériences de knockdown médiées par l’ARNi. Bien que l’ARNi de Nasonia ait été décrit pour la première fois par Lynch et Desplan en 200610, il n’existe aucune procédure visuelle disponible pour la façon dont les injections d’ARNi sont effectuées. L’ARNi a récemment été utilisé pour découvrir le gène haploïdisant du chromosome B PSR (Paternal Sex Ratio)3 et pour étudier l’implication du gène horloge, période,chez N. vitripennis rythmes biologiques7.
Les pupes noires et les guêpes adultes peuvent être utilisées pour induire l’édition du gène crispr/cas9 germinal à l’aide des protocoles ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) et BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Ces deux méthodes d’administration d’ovaires ont été récemment décrites comme étant efficaces chez Nasonia pour générer des mutations germinales dans le gène cible, le cinabre7,12. Ici, un protocole simplifié est fourni pour les injections, y compris une procédure visuelle d’une méthodologie étape par étape pour les injections nymphales et adultes qui peut être utilisée pour générer des études de génétique fonctionnelle dans Nasonia et probablement chez d’autres guêpes parasitoïdes, sans nécessiter d’équipement spécialisé et en contournant les microinjections embryonnaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec l’utilisation accrue récente de Nasonia vitripennis comme organisme modèle pour diverses questions biologiques2,3,7,17,il est nécessaire de développer et d’optimiser des méthodes d’injection pour permettre un protocole simplifié et efficace pour l’analyse fonctionnelle des gènes de N. vitripennis. Les méthodes actuelles impliquant la microinjection embryon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par des fonds de démarrage de l’UCSD dirigés vers O.S.A. et des 1645331 de subvention NSF /BIO à J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
