זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס
Summary
כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.
Abstract
צרעת התכשיטים, נסוניה ויטריפניס, הפכה למערכת מודל יעילה לחקר אפיגנטיקה של קביעת מין haplo-diploid, ביולוגיה של כרומוזום B, אינטראקציות מארח סימביונט, דגימה, סינתזת ארס. למרות הזמינות של מספר כלים מולקולריים, כולל CRISPR /Cas9, מחקרים גנטיים תפקודיים עדיין מוגבלים באורגניזם זה. המגבלה העיקרית של יישום טכנולוגיית CRISPR/Cas9 ב- N. vitripennis נובעת מהאתגרים של מיקרו-אינג’ים עובריים. זריקות של עוברים קשות במיוחד באורגניזם זה ובכלל בצרעות טפיליות רבות, בשל גודל עובר קטן והדרישה של גולם מארח להתפתחות עוברית. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, Cas9 ribonucleoprotein משלוח מורכב לתוך השחלות הנשיות על ידי הזרקת מבוגרים, ולא microinjection עוברי, היה אופטימיזציה, וכתוצאה מכך הן עריכות נבט סומטי תורשה. הליכי ההזרקה היו אופטימיזציה של גורים וצרעות נקבה באמצעות בקרת ReMOT (טרנסדוקציה השחלות בתיווך קולטן של מטען) או BAPC (קפסולות פפטיד אמפיפיליות מסועפות). שיטות אלה מוצגות כאלטרנטיבות יעילות להזרקת עוברים, המאפשרות מוטציות חיידקים ספציפיות לאתר ותורמיות.
Introduction
CRISPR / Cas9 עריכת גנים היא טכנולוגיה רבת עוצמה למחקרים גנטיים תפקודיים, במיוחד באורגניזמים מודל עולה רבים כגון צלופת התכשיט, Nasonia vitripennis. קלות ההתרבות והזמינות של גנום שלם הופכים את צלופת התכשיט למערכת ניסיונית חשובה להבהרת המנגנונים המולקולריים של תהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, N. vitripennis שימש לאחרונה כדי לפענח את הבסיס האפיגנטי של מערכת קביעת מין haplodiploid1,2, הביולוגיה של כרומוזומי B3,4,5,6, ואת הבסיס הגנטי עבור ויסות ביולוגי ועונתי7,8. חלק מהתכונות שהופכות N. vitripennis נוח לעבוד עם כוללים זמן הדור הקצר (~ 2 שבועות ב 25 °C (69 °F), שיעורי רבייה גבוהים, הפרדת מין קלה בשלב pupal, ואת היכולת diapause ולאחסן זנים ב 4 °C (69 °F). מחזור החיים מתחיל עם צרעות נקבה טפילים הגומות של blowfly, סרקופגה bullata. דרך הביצית שלהם, הנקבות מטילות עד 50 ביצים במקרה הפופאלי של הזיוף. ביצים מתפתחות לזחלים הניזונים מגולם S. bullata, ממשיכים להתפתח במהלך הימים הקרובים, ולאחר מכן גור, ואחריו eclosion למבוגרים והופעתו מן puparium המארח9.
כלים מולקולריים לביצוע מחקרים גנטיים תפקודיים ב- N. vitripennis, כגון הפרעות RNA (RNAi)10 ו- CRISPR/Cas911,12, זמינים, אך מוגבלים, בעיקר בשל קשיים בביצוע microinjections עוברי13. כמו N. vitripennis ביצים דורשים מארח pupal לפיתוח, מניפולציה ביצה הוא מאוד מאתגר. יש לאסוף עוברי במה שלפני הפיצוץ מהגלמים המארחים, לעבור במהירות מיקרו-אינג’פקט, ולהעבירם מיד חזרה למארח לפיתוח13. צעדים אלה דורשים דיוק והכשרה מיוחדת כדי למנוע פגיעה בעוברים microinjected או המארחים pupal13. יתר על כן, הביצים קטנות מאוד ושבירות, במיוחד לאחר microinjections, עם ציטופלסמה צמיגה מאוד גורם סתימת מתמשך של מחט הזרקת13. תכונות אלה הופכות את המיקרו-אינג’ים העובריים למאתגרים במיוחד, ודורשים מפעילים מיומנים וציוד מיוחד הנעדר ברוב מעבדות N. vitripennis.
אופטימיזציה של שיטות הזרקה חלופיות לאספקת ריאגנטים CRISPR יתרום לאיחוד של N. vitripennis כאורגניזם מודל. המניפולציה של גולם ומבוגרים היא פחות מאתגרת מאשר מניפולציה עוברים והוא יכול להתבצע עם הגדרת הזרקה בסיסית. כאן מתוארים שני פרוטוקולים להזרקת גלמים ומבוגרים: האחד כולל ציוד מיוחד לזריקות, והשני כולל שימוש במכלול צינור שאיפה המצויד במחט נימי זכוכית. השימוש בצינור שאיפה מתאים במיוחד למעבדות שאין להן גישה לציוד מיוחד למיקרו-אינג’ים של עוברים. זריקות יעילות של שלבים התפתחותיים שונים של N. vitripennis, כולל גולים לבנים או שחורים וצעות למבוגרים, הם הפגינו. צרעות בשלב הגומה הלבנה מתאימות במיוחד לניסויי הפלה בתיווך RNAi. למרות RNAi ב Nasonia תואר לראשונה על ידי לינץ ‘ו Desplan בשנת 200610, אין הליך חזותי זמין עבור איך זריקות RNAi מבוצעים. RNAi שימש לאחרונה כדי לגלות את הגן haploidizer של PSR כרומוזום B (יחס מין אבהי)3 וללמוד את המעורבות של גן השעון, נקודה, במקצבים ביולוגיים N. vitripennis 7.
ניתן להשתמש בגולם שחור ובצרעות למבוגרים כדי לגרום לעריכת גנים של נבטים CRISPR/Cas9 באמצעות ReMOT Control (התמרת השחלות בתיווך קולטן של מטען) ופרוטוקולי BAPC (כמוסות פפטיד אמפיפיליות מסועפות). שתי שיטות אלה משלוח השחלות תוארו לאחרונה להיות יעיל Nasonia ליצירת מוטציות נבט בגן היעד, cinnabar7,12. כאן, פרוטוקול פשוט מסופק עבור זריקות כולל הליך חזותי של מתודולוגיה צעד אחר צעד עבור זריקות ומבוגרים כאחד שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מחקרים גנטיים תפקודיים Nasonia וסביר צרעות טפיליות אחרות, ללא צורך בציוד מיוחד ועקיפת microinjections עוברי.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם השימוש המוגבר האחרון של Nasonia vitripennis כאורגניזם מודל לשאלות ביולוגיות שונות2,3,7,17, יש צורך לפתח ולייעל שיטות הזרקה כדי לאפשר פרוטוקול פשוט ויעיל לניתוח תפקודי של N. vitripennis גנים. השיטות הנוכחיות הכרוכות במיקרו-א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות סטארט-אפ UCSD המופנות למענק O.S.A. ו- NSF / BIO 1645331 לג’יי.אל.אר.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
