Pupal og voksen injeksjoner for RNAi og CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis
Summary
Her beskriver vi metoder for effektive pupal- og vokseninjeksjoner i Nasonia vitripennis som tilgjengelige alternativer til embryomikroinjeksjon, noe som muliggjør funksjonell analyse av gener av interesse ved hjelp av enten RNA-silencing via RNA-interferens (RNAi) eller gen knockout via CRISPR / Cas9 genomredigering.
Abstract
Juvelvevepsen, Nasonia vitripennis, har blitt et effektivt modellsystem for å studere epigenetikk av haplo-diploid sexbestemmelse, B-kromosombiologi, vertssympymiske interaksjoner, spesiering og giftsyntese. Til tross for tilgjengeligheten av flere molekylære verktøy, inkludert CRISPR / Cas9, er funksjonelle genetiske studier fortsatt begrenset i denne organismen. Den største begrensningen ved bruk av CRISPR/Cas9-teknologi i N. vitripennis stammer fra utfordringene ved embryonale mikroinjeksjoner. Injeksjoner av embryoer er spesielt vanskelig i denne organismen og generelt i mange parasitoidveps, på grunn av liten embryostørrelse og kravet om en vertsvalpe for embryonal utvikling. For å løse disse utfordringene ble Cas9 ribonucleoprotein kompleks levering til kvinnelige eggstokkene ved vokseninjeksjon, i stedet for embryonal mikroinjeksjon, optimalisert, noe som resulterte i både somatiske og arvelige bakterieredigeringer. Injeksjonsprosedyrene ble optimalisert i pupper og kvinnelige veps ved hjelp av enten ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) eller BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Disse metodene viser seg å være effektive alternativer til embryoinjeksjon, noe som muliggjør stedsspesifikke og arvelige bakteriemutasjoner.
Introduction
CRISPR/Cas9 genredigering er en kraftig teknologi for funksjonelle genetiske studier, spesielt i mange stigende modellorganismer som juvel veps, Nasonia vitripennis. Den enkle oppdretten og tilgjengeligheten av et komplett genom gjør juvelvevepsen til et viktig eksperimentelt system for å belyse molekylære mekanismer i forskjellige biologiske prosesser. For eksempel har N. vitripennis nylig blitt brukt til å avdekke det epigenetiske grunnlaget for haplodiploid sexbestemmelsessystem1,2, biologien til B-kromosomene3,4,5,6og det genetiske grunnlaget for circadian og sesongregulering7,8. Noen av funksjonene som gjør N. vitripennis egnet til å jobbe med inkluderer kort generasjons tid (~ 2 uker ved 25 °C), høye reproduksjonshastigheter, enkel kjønnsseparasjon på puppetrinnet og evnen til å diapause og lagre stammer ved 4 °C. Livssyklusen begynner med kvinnelige hvepe som parasiterer blowflyens pupper, Sarcophaga bullata. Gjennom sin ovipositor legger kvinner opptil 50 egg i puppetuiet av blowflyen. Egg utvikler seg til larver som spiser på S. bullata pupa, fortsetter å utvikle seg i løpet av de neste dagene, og deretter puperer, etterfulgt av voksen eklosjon og fremvekst fra verten puparium9.
Molekylære verktøy for å utføre funksjonelle genetiske studier i N. vitripennis, for eksempel RNA-interferens (RNAi)10 og CRISPR / Cas911,12, er tilgjengelige, men er begrenset, hovedsakelig på grunn av vanskeligheter med å utføre embryonale mikroinjeksjoner13. Siden N. vitripennis egg krever en pupal vert for utvikling, egg manipulasjon er svært utfordrende. Pre-blastoderm stadium embryoer må samles fra verten blowfly pupper, raskt mikroinjisert, og umiddelbart overført tilbake til verten for utvikling13. Disse trinnene krever presisjon og spesialisert trening for å unngå å skade de mikroinjiserte embryoene eller puppevertene13. Videre er eggene svært små og skjøre, spesielt etter mikroinjeksjoner, med en veldig viskøs cytoplasma som forårsaker en kontinuerlig tilstopping av injeksjonsnålen13. Disse funksjonene gjør embryonale mikroinjeksjoner usedvanlig utfordrende, og krever høyt utdannede operatører og spesialisert utstyr som er fraværende i de fleste N. vitripennis laboratorier.
Optimalisering av alternative injeksjonsmetoder for levering av CRISPR-reagenser vil bidra til konsolidering av N. vitripennis som modellorganisme. Manipulering av pupper og voksne er mindre utfordrende enn å manipulere embryoer og kan oppnås med et grunnleggende injeksjonsoppsett. Her er to protokoller beskrevet for injeksjon av pupper og voksne: den ene involverer spesialisert utstyr for injeksjoner, og den andre involverer bruk av en aspiratorrørmontering utstyrt med en glasskapillær nål. Bruken av et aspiratorrør er spesielt egnet for laboratorier som ikke har tilgang til spesialisert utstyr for embryomikroinjeksjoner. Effektive injeksjoner av ulike utviklingsstadier av N. vitripennis, inkludert hvit eller svart pupper og voksenveps, demonstreres. Wasps på den hvite puppetrinnet er spesielt egnet for RNAi-medierte knockdown-eksperimenter. Selv om RNAi i Nasonia først ble beskrevet av Lynch og Desplan i 200610, er det ingen visuell prosedyre tilgjengelig for hvordan RNAi-injeksjoner utføres. RNAi ble nylig brukt til å oppdage haploidizer genet av B-kromosomet PSR (Paternal Sex Ratio)3 og for å studere involvering av klokkegenet, periode, i N. vitripennis biologiske rytmer7.
Svart pupper og voksne veps kan brukes til å indusere CRISPR/Cas9 germline genredigering ved hjelp av ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) og BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules) protokoller. Disse to eggstokkleveringsmetodene har nylig blitt beskrevet å være effektive i Nasonia for å generere bakteriemutasjoner i målgenet, cinnabar7,12. Her er en forenklet protokoll gitt for injeksjoner, inkludert en visuell prosedyre for en trinnvis metodikk for både pupal og voksen injeksjoner som kan brukes til å generere funksjonelle genetikkstudier i Nasonia og sannsynligvis i andre parasitoidveps, uten å kreve spesialisert utstyr og omgå embryonale mikroinjeksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den nylig økte bruken av Nasonia vitripennis som modellorganisme for ulike biologiske spørsmål2,3,7,17, er det behov for å utvikle og optimalisere injeksjonsmetoder for å muliggjøre en forenklet og effektiv protokoll for funksjonell analyse av N. vitripennis gener. De nåværende metodene som involverer embryonal mikroinjeksjon av genredigeringsreagenser er utfordren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av UCSDs oppstartsfond rettet mot O.S.A. og NSF/BIO grant 1645331 til J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
