Summary

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

Published: April 30, 2021
doi:

Summary

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

Abstract

מודלים מורכבים של מחלות דורשים כלים חדשניים המסוגלים לספק תובנות פיזיולוגיות ופתולוגיות רלוונטיות וניתנות לפעולה, ולחשוף תהליכים בלתי נראים אחרת. מבחני תאים מתקדמים המחקים באופן הדוק את נוף in vivo מבססים את עצמם כדרכים חדשות לדמיין ולמדוד את יחסי הגומלין הדו-כיווניים בין הגידול למארח המשפיעים על התקדמות הסרטן. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים רב-תכליתיים ליצירת תרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות הניתנות לשליטה גבוהה במיקרו-מכשירים, המחקים את המורכבות של מיקרו-סביבה גידולית (TME), תחת מעקב חיסוני טבעי ומונע טיפול. בחלק 1, ניתנת הגדרה ניסיונית לניטור crosstalk בין תאי גידול דבקים לבין אוכלוסיות חיסוניות צפות, על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר בהילוך מהיר. כתרחיש אפליקטיבי, אנו מנתחים את ההשפעות של טיפולים אנטי-סרטניים, כגון מה שמכונה גורמים אימונוגניים למוות של תאי סרטן על גיוס והפעלה של תאים חיסוניים. בסעיף 2, מיקרו-סביבות תלת-ממדיות של גידולים חיסוניים מורכבים בפריסה תחרותית. חדירה חיסונית דיפרנציאלית מנוטרת על ידי תמונות פלואורסצנטיות עד 72 שעות, כדי להעריך אסטרטגיות טיפוליות משולבות. בשתי ההגדרות, שלבי עיבוד תמונה מתוארים כדי לחלץ שפע של פרמטרים של תאי מערכת החיסון (למשל, נדידת תאי מערכת החיסון ואינטראקציה, תגובה לחומרים טיפוליים). שיטות פשוטות וחזקות אלה יכולות להיות מותאמות עוד יותר כדי לדמות את המורכבות של TME המקיפה את ההטרוגניות והפלסטיות של תת-סוגים של תאי סרטן, סטרומה ותאי חיסון, כמו גם את יחסי הגומלין שלהם כמניעים של אבולוציה של סרטן. התאימות של טכנולוגיות אלה המתפתחות במהירות עם הדמיה של תאים חיים עם תוכן גבוה יכולה להוביל ליצירת מערכי נתונים אינפורמטיביים גדולים, ולהביא אתגרים חדשים. ואכן, המשולש “תרביות משותפות/מיקרוסקופיה/ניתוח נתונים מתקדם” סולל את הדרך לפרמטריזציה מדויקת של הבעיה שעשויה לסייע לפרוטוקולים טיפוליים מותאמים אישית. אנו צופים כי שילוב עתידי של חיסון לסרטן על שבב עם בינה מלאכותית לעיבוד בתפוקה גבוהה יהווה סינרגיה גדולה קדימה במינוף היכולות ככלי חיזוי ופרה-קליניים לאונקולוגיה מדויקת ומותאמת אישית.

Introduction

האבולוציה של ענפי רפואה שונים כדיסציפלינות ניסיוניות הייתה תלויה ביכולת לתמרן את אוכלוסיית התאים ואת תפקודי האיברים בתנאים מבוקרים1. שורשיה של יכולת זו נעוצים בזמינותם של מודלים מדידים המסוגלים לשחזר תהליכים המתרחשים בגופנו.

בעידן האימונותרפיה ופרופיל גנומי חד-תאי 2, הביולוגיה של הסרטן צריכה לנצל את המודלים המתפתחים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני תקין 2,3.

מיקרו-סביבהגידולית 4 (TME) היא רקמה מורכבת שבה תאים סרטניים מתקשרים ברציפות ומתפתחים באופן דינמי עם תאים אחרים (תאי מערכת החיסון, סטרומה ואנדותל) ושאינם תאיים (המטריצה החוץ תאית, ECM). האופי הדינמי של הנוף המורכב הזה מכתיב אם תאי מערכת החיסון משחקים כחברים או אויבים של תאים ממאירים, ובכך משפיע מאוד הן על התקדמות המחלה והן על התגובה לטיפול. כיום, מאמצים גדולים של אונקו-אימונולוגים, ביואינפורמטיקאים ומומחים לביולוגיה מערכתית מתכנסים כדי להתמודד עם המשמעות הקלינית של הטרוגניות סרטן 5,6, הן במרחב (כלומר, באזורים גידוליים נפרדים) והן בזמן (כלומר, בשלבי התקדמות גידול מובהקים)5,6, ולאפיין פנוטיפ סרטן ותאי חיסון ולתפקד ברמה של תא יחיד. כדוגמה לסינרגיה זו, טכניקות מתקדמות של ראייה ממוחשבת משמשות כיום באופן שגרתי למיפוי מרחבי של חדירת מערכת החיסון בדגימות היסטולוגיות 7,8.

בחזית המודלים הניסיוניים, המגשרים בין מחקרים בבעלי חיים לבין שיטות מסורתיות במבחנה, ההתקדמות במיקרופלואידיקה ובטכניקות של תרבית משותפת מעניקה גישה לסוגים שונים של מודלים תאיים מהונדסים מיקרו כגון אורגנואידים, מערכות מיקרו-פיזיולוגיות 9,10,11 (MPS) ואיברים על שבב12,13,14 (OOC). הם חולקים את התכונה המשותפת להתמקד במבט “התמונה הגדולה” של המערכות האקולוגיות הסלולריות ולהרחיב את הפוטנציאל במבחנה לשלוט בגורמים מיקרו-סביבתיים תוך ניצול מיקרוסקופ15 בעל תוכן גבוה וגישות עיבוד תמונה.

כיום, מערכות MPS ו- OOC חדישות החלו לכלול היבטים אימונולוגיים , המשלבים תת-סוגים שונים של תאים חיסוניים ברקמות קיימות ובתרביות משותפות, כדי לחקור ולמדוד מגוון תהליכים כמו מחלות דלקתיות, ריפוי פצעים, חסינות רירית ותגובה לרעלים או מוצרי מזון יומיומיים16. דגמי TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, המשולבים גם עם מיקרו-כלים מתבלבלים 18,19,20,21, פותחו כדי לחקור אינטראקציות תלויות סוג תא, הפרעות פיזיקליות וכימיות והפעילות ציטוטוקסית של חדירת לימפוציטים22, כמו גם חומרים אימונומודולטוריים רלוונטיים מבחינה קלינית23.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים רב-תכליתיים, החל מטעינת תאים בשבבים ועד לכלי עיבוד תמונה, לניצול תרביות מיקרופלואידיות מתקדמות של גידולים וגידולים בדו-ממד (סעיף 1) ובתלת-ממד (סעיף 2)הגדרות 16, התואמות לניטור והדמיה דינמיים ורב-פרמטריים של24 פונקציות תאיות. זה מושג תוך שמירה על קלות השימוש והגמישות הן בניהול דגימות והן בניתוח נתונים, תוך ניצול תוכנת התוכנה החופשית של פיג’י וארגזי הכלים שלה25,26.

המכשיר המיקרופלואידי, המתואר בסעיף 1, נועד לבצע תרביות דו-ממדיות של סרטן דבק ותאים חיסוניים צפים. פלטפורמה זו אומתה למדידה חוץ גופית של התנהגות תאי מערכת החיסון בנוכחות מוטציות גנטיות27 ו/או ליקויים חיסוניים28. כאן, אנו מדגימים שלבים למעקב אחר תאי מערכת החיסון בתמונות שדה בהיר בהילוך מהיר, על ידי ניצול שיטה חצי-אוטומטית המבוססת על Trackmate (תוסף המיושם בתוכנת פיג’י). הליך זה מאפשר חילוץ של תיאורים קינמטיים של נדידת מערכת החיסון 29 ותגובה (כלומר, זמני אינטראקציה) כדי להתמקד בתאים סרטניים, מטופלים או לא עם גורמים למוות של תאים אימונוגניים27.

חשוב לציין כי פרמטרים אלה, המופקים מתמונות מסדרות זמן, ניתנים לעיבוד באמצעות מכונות מתמטיות מתקדמות. כדוגמה לפוטנציאל של גישה זו, הקבוצות שלנו פרסמו לאחרונה ניתוח המבוסס על שיטות מתמטיות מתהליכים סטוכסטיים ומכניקה סטטיסטית כדי למדל תכונות רשת תאית ולספק תיאור פרמטרי של התנהגות תאי מערכת החיסון (כלומר, הליכה אקראית מוטה או לא מתואמת, תנועה מתואמת מאוד או לא מתואמת30,31).

ההגדרה התלת-ממדית, המסופקת בחלק השני, מבוססת על פרוטוקול תרבית משותפת כדי ליצור מחדש TMEs מורכבים יותר של מערכת החיסון המשובצים בשני אזורי ג’ל עם שילובים שונים של סוגי תאים ותרופות באופן תחרותי. כאן, מתוארים שלבי עיבוד תמונה כדי למדוד, בנקודות זמן שונות, את החדירה של תאי חיסון מוכתמים בתאי מלנומה A375M אנושיים המעובדים בתוך מטריג’ל, כדי להעריך שילובים של חומרים אנטי-סרטניים32. קו A375M, קו תאים נגזר A375P המאופיין בפנוטיפ גרורתי מאוד נבחר כדי להעריך את יכולתם הגרורתית בנוכחות תאי חיסון32.

המודלים המתוארים יכולים להיות תואמים באופן מלא עם מקורות תאים שונים (מורין ובני אדם אימורטליזציה או קווי תאים ראשוניים, אורגנואידים, xenografts, בין היתר). במחקרים האחרונים של המעבדה שלנו, על ידי שילוב של מיקרוסקופ וידאו בתוכן גבוה עם ניתוח תמונה, הפריסה התלת-ממדית התחרותית יושמה כדי לחקור: i) תגובה חיסונית אנטי-גידולית (ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלוית נוגדנים, ADCC) ולנתח את התפקיד של פיברובלסטים בעמידות לטיפול בטרסטוזומאב במודלים של סרטן שד HER2+ על שבב33; 2) פעולתם של תאים מיאלואידים (כלומר, מקרופאגים הקשורים לסרטן) במנגנוני התחמקות הגידול וגיוס תאי T34; iii) יעילותם של משטרים אימונותרפיים, המבוססים במיוחד על תאים דנדריטיים מותנים אינטרפרון-α (IFN-DCs), המעובדים עם תאי סרטן המעי הגס שטופלו בתרופות במטריצות קולגן, ולהעריך תנועה יעילה ואת אירועי הפאגוציטוזה הבאים35; iv) נדידה כימוטקטית של אאוזינופילים שמקורם במח עצם לעבר תאי מלנומה IL-33 שטופלו או לא טופלו36.

מודלים מתקדמים אלה יכולים לשמש חלונות תצפית להבנת תפקיד מרקם החיסון בגרורות סרטניות ובמנגנוני עמידות, אך נדרשים מאמצים לתרגם את הממצאים למרפאות, ובכך לסגור את הפער במחקר בסיסי37.

כתרחיש מתפתח, רתימת כוחה של מיקרוסקופיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה בשילוב עם שימוש במיקרו-מערכות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית פותחת אתגרים פוטנציאליים חדשים לטיפול, עיבוד ופרשנות של מאות, ואפילו אלפי, ג’יגה-בייט של נתונים רב-פרמטריים, שניתן להפיק מקמפיין ניסיוני יחיד. משמעות הדבר היא קשר ישיר של ניסויי OOC עם אלגוריתמים מבוססי בינה מלאכותית 38,39,40,41,42 (AI) הן לניתוח אוטומטי מתקדם, והן ליצירת תכונות שיכולות להזין בתורן מודלים סיליקו של יחסי גומלין בין סרטן למערכת החיסון 43, עם יישומים חדשים ומלהיבים באופק, כגון פיתוח מבחני סינון תרופות מנבאים 44.

זרם הולך ומתרחב של מאמצים מתמקד בעיצוב מודלים של מחלות במשותף עם אופטימיזציה של אסטרטגיות ליישום מסכי הפרעה בקנה מידה גדול עם קריאות multi-omics תא יחיד. זה ללא ספק יעזור לפיתוח, ובתקווה, ליישום הקליני, המלווה במידה מתאימה של סטנדרטיזציה של שיטה, של גישה אונקו-אימונולוגיה-על-שבב שיטתית כדי לקבל תובנות חדשות על הפרעות חיסוניות ומנגנוני הפצת סרטן.

Protocol

1. תכנון שבבים לתאים דבקים וצפים בתרביות דו-ממדיות הערה: פריסת התרבית המשותפת הדו-ממדית (איור 1A-C) מאופיינת בשלושה תאים (בגובה 100 מיקרומטר) המחוברים ביניהם באמצעות שתי קבוצות של מערכים מיקרו-ערוציים (500 x 12 x 10 מיקרומטר…

Representative Results

חדירה חיסונית של הגידול היא פרמטר של התגובה האנטי-סרטנית של המארח. גידולים הם הטרוגניים בהרכב, צפיפות, מיקום ומצב תפקודי של לויקוציטים חודרים, אשר אינטראקציות עם תאים סרטניים יכולות לעמוד בבסיס מידע רלוונטי מבחינה קלינית לחיזוי מהלך המחלה והתגובה לטיפול. במובן זה, טכנולוגיות מיקרופלואיד?…

Discussion

השיטות המתוארות מנסות לעצב גישה כללית כדי לשחזר, עם מידת מורכבות ניתנת לשינוי, שני היבטים משמעותיים בתחום האונקו-אימונולוגיה, אשר יכולים להפיק תועלת מאימוץ מודלים רלוונטיים יותר במבחנה. הראשון נוגע לצד אוכלוסיית תאי הגידול, שם התמודדות עם מאפייני תא בודד עשויה להוביל לתיאור טוב יותר של ה?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Cell culture materials 
50 mL tubes Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS430828 centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC Millipore-Sigma; St. Louis, MO A3656 DNA-hypomethylating agent
6-well plates Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS3506 culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask Corning, New York, NY 430641U culture flasks
A365M American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222
human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride Millipore-Sigma; St. Louis, MO D1515 anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0728L Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium EuroClone Spa, Milan, Italy ECB4004L saline buffer solution
Fetal Bovine Serum EuroClone Spa, Milan, Italy ECS0180L ancillary for cell culture
Ficoll GE-Heathcare 17-1440-02 separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometer Neubauer Cell counter
Heparinized vials Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b Millipore-Sigma; St. Louis, MO SRP4595 recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3000D ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media Cedarlane Labs, Burlington, Canada Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel Corning, New York, NY 354230 growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26 human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3001D ancillary for cell culture
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201 Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH26GL red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH67GL green fluorescent cell dye
RPMI-1640 EuroClone Spa, Milan, Italy ECM2001L Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 15250061 cell stain to assess cell viability
Trypsin EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0920D dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator  Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C) FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Steril VBH 72 MP Laminar flow hood
Optical microscope Zeiss
Refrigerable centrifuge Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) Sigma Aldrich A3648 silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ  MB W&A,  Germany optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm) Ibidi, Germany 10812
Hydrogen Peroxide solution 30% Carlo Erba Reagents 412081 reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone Carlo Erba Reagents 461945 PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm  Sail Brand 7101 substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm Tedpella dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa Allresist,Germany AR-P. 679.04 Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips Ibidi, Germany 10813 substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped Gambetti Xenologia Srl, Italy 30255
Propan-2-ol Carlo Erba Reagents 415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Sigma Aldrich 484431-4L SU-8 resists developer
SU-8 3005 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0001 Negative Photoresists
SU-8 3050 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0005 Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm Tedpella 15111-40, 15111-60, 15111-80 dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96% Carlo Erba Reagents 410381 reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dowsil, Dow Corning 11-3184-01 Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS) Sigma Aldrich 92360-100ML silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

References

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. . Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, 282 (2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -. H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -. T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235 (2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639 (2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737 (2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2′-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450 (2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093 (2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664 (2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985 (2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine – Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789 (2019).
  54. Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -. Y., Herbert, S. . The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT – Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014 (2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  84. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  85. Ingber, D. E. Developmentally inspired human ‘organs on chips.’. Development. , (2018).
  86. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  87. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  88. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16 (2019).
  89. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  90. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).
check_url/kr/61895?article_type=t

Play Video

Cite This Article
De Ninno, A., Bertani, F. R., Gerardino, A., Schiavoni, G., Musella, M., Galassi, C., Mattei, F., Sistigu, A., Businaro, L. Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments. J. Vis. Exp. (170), e61895, doi:10.3791/61895 (2021).

View Video